精原干細(xì)胞是精子發(fā)生的基礎(chǔ),位于睪丸曲細(xì)精管的基底膜,通過自我更新和分化源源不斷地產(chǎn)生精子,以維持整個雄性生命過程中的生育能力。精原干細(xì)胞在遺傳資源的保存、不孕不育和遺傳疾病治療等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。但是脂質(zhì)體或電轉(zhuǎn)等方法轉(zhuǎn)染精原干細(xì)胞的效率都低,限制了精原干細(xì)胞的研究與應(yīng)用。聚酰胺-胺樹狀大分子（PAMAM）作為一種納米材料,具有獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu),它的表面電荷和高密度的表面基團(tuán)適合配體附著并具有促進(jìn)靶向遞送的作用。鑒于此,本研究以小鼠未分化A型精原細(xì)胞來源的C18-4細(xì)胞和原代精原干細(xì)胞作為研究對象,選擇第五代PAMAM（G5）樹狀大分子,通過酰胺反應(yīng)修飾cRGD多肽,合成PAMAM-cRGD（G5-cRGD）樹狀大分子,分析G5-cRGD樹狀大分子的物理化學(xué)特性、細(xì)胞毒性、內(nèi)涵體逃逸能力和基因沉默效率,探究G5-cRGD是否能作為有效的基因遞送載體負(fù)載siRNA轉(zhuǎn)染精原干細(xì)胞,為精原干細(xì)胞后續(xù)的研究和臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)和提供有效的手段。主要研究結(jié)果如下:1、G5-cRGD能完全結(jié)合并負(fù)載siRNA。首先,通過紅外光譜檢測到G5-cRGD成功合成。其次,通過透射電鏡觀察到G5呈不規(guī)則... 

【文章來源】：西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：62 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 精原干細(xì)胞研究綜述
        1.1.1 精原干細(xì)胞簡介
        1.1.2 精原干細(xì)胞的分子標(biāo)記
        1.1.3 精原干細(xì)胞的增殖與分化調(diào)控
        1.1.4 精原干細(xì)胞應(yīng)用
    1.2 RNA干擾技術(shù)
    1.3 基因載體
    1.4 聚酰胺-胺樹狀分子
        1.4.1 聚酰胺-胺樹狀分子的性質(zhì)及制備方法
        1.4.2 聚酰胺-胺樹狀分子在基因遞送上的應(yīng)用前景
        1.4.3 聚酰胺-胺樹狀分子在藥物遞送上的應(yīng)用前景
    1.5 本研究的目的和意義
第二章 G5-cRGD的合成及表征
    2.1 材料和方法
        2.1.1 材料
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 G5-cRGD材料的合成
        2.1.4 傅里葉變換紅外光譜(FTIR)
        2.1.5 透射電鏡觀察納米復(fù)合物的形態(tài)和粒徑
        2.1.6 凝膠阻滯試驗(yàn)
        2.1.7 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代
        2.1.8 CCK-8檢測細(xì)胞毒性
    2.2 結(jié)果
        2.2.1 G5-cRGD的合成
        2.2.2 G5-cRGD的表征
        2.2.3 G5-cRGD的細(xì)胞毒性
    2.3 討論
    2.4 小結(jié)
第三章 G5-cRGD在精原干細(xì)胞系的攝取和負(fù)載siRNA的能力
    3.1 材料與方法
        3.1.1 材料
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 細(xì)胞系培養(yǎng)與傳代
        3.1.4 siRNA轉(zhuǎn)染C18-4細(xì)胞系
        3.1.5 流式細(xì)胞檢測
        3.1.6 攝取機(jī)制檢測
        3.1.7 溶酶體逃逸檢測
        3.1.8 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄
        3.1.9 定量PCR
        3.1.10 Western Blot
        3.1.11 CCK-8檢測細(xì)胞增殖
        3.1.12 EdU檢測細(xì)胞增殖
    3.2 結(jié)果
        3.2.1 G5-cRGD的胞內(nèi)定位
        3.2.2 G5-cRGD遞送siRNA的效率
        3.2.3 G5-cRGD-siRNA復(fù)合物的攝取途徑
        3.2.4 G5-cRGD-siRNA復(fù)合物的內(nèi)涵體逃逸能力
        3.2.5 G5-cRGD負(fù)載Cdk1+Cdk2 siRNA沉默靶基因和抑制細(xì)胞增殖
    3.3 討論
    3.4 小結(jié)
第四章 G5-cRGD在原代精原干細(xì)胞的攝取和負(fù)載siRNA的能力
    4.1 材料與方法
        4.1.1 材料
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 小鼠原代精原干細(xì)胞的分離與富集
        4.1.4 豬原代精原干細(xì)胞的分離與富集
        4.1.5 siRNA轉(zhuǎn)染原代精原干細(xì)胞
        4.1.6 細(xì)胞免疫熒光
        4.1.7 RNA提取與定量PCR
        4.1.8 雄性生殖干細(xì)胞來源的克隆數(shù)評定
        4.1.9 EdU檢測細(xì)胞增殖
        4.1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
    4.2 結(jié)果
        4.2.1 G5-cRGD-siRNA復(fù)合物在小鼠原代精原干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率
        4.2.2 G5-cRGD負(fù)載Cdk1+Cdk2 siRNA沉默靶基因和抑制細(xì)胞增殖
        4.2.3 G5-cRGD-siRNA復(fù)合物在豬原代精原干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率
    4.3 討論
    4.4 小結(jié)
結(jié)論與創(chuàng)新點(diǎn)
    結(jié)論
    創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡介


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]聚酰胺-胺（PAMAM）樹狀大分子的研究進(jìn)展[J]. 崔玉花,尹少宏,崔玉,孫國新.  濟(jì)南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版). 2007(04)



本文編號：3422821