艾美耳球蟲（Eimeria）是一類專性胞內(nèi)寄生性頂復(fù)門原蟲，可以嚴(yán)重危害集約化養(yǎng)雞業(yè)生產(chǎn)。目前，雞球蟲病的主要防治手段是藥物和活卵囊疫苗，但二者都存在不可逾越的障礙，這就需要尋求雞球蟲疫苗發(fā)展的新方向。本試驗為了研究雞球蟲基因工程疫苗，以致病力最強(qiáng)的柔嫩艾美耳球蟲為研究對象，選取其四個關(guān)鍵的入侵相關(guān)蛋白分子（頂膜抗原及棒狀體頸部蛋白），利用生物信息學(xué)分析其關(guān)鍵功能結(jié)構(gòu)域，利用重疊延伸PCR技術(shù)連接功能結(jié)構(gòu)域的表達(dá)基因，將其嵌合為一個多表位的抗原，對該嵌合抗原進(jìn)行真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建，制備DNA疫苗，并對其免疫保護(hù)效果進(jìn)行評價分析。首先利用生物信息學(xué)與比較基因組學(xué)技術(shù)，注釋拼接到柔嫩艾美耳球蟲（E.tenella）入侵相關(guān)蛋白（EtAMA1，EtMA1，EtMA2和EtRON2）的基因序列，以預(yù)測的序列設(shè)計引物，以E.tenella（廣東株）第二代裂殖子總RNA為模板，用PCR方法擴(kuò)增出這四種基因的開放閱讀框（ORF）序列；通過在線軟件，對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析；再分別設(shè)計引物，從這四種基因的全長序列中擴(kuò)增胞外區(qū)的DⅡ結(jié)構(gòu)域，并通過SOE PCR技術(shù)將其構(gòu)建成一個可串聯(lián)表達(dá)的嵌合抗原基因片段，... 

【文章來源】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)河南省

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

E.tenella第二代裂殖子總RNA

方法抽提的總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示清晰三條-1）。圖 1-1 E.tenella 第二代裂殖子總 RNAFig. 1-1 Total RNA ofE.tenella second generation merozitestMA1、EtMA2 和 EtRON2 基因的 PCR 擴(kuò)增結(jié)果、EtMA1、EtMA2 和 EtRON2 基因序列，用設(shè)計的引物對增，產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果分別擴(kuò)增獲得約 1的片段（圖 1-2）。

白（如圖 1-3）。圖 1-3 EtMA1 和 EtMA2 的 NCBI BLAST 結(jié)果Fig.1-3 TheNCBI BLAST results of EtMA1 and EtMA2A: EtMA1 B: EtMA2對分析和 EtMA2 氨基酸序列同頂復(fù)門其他蟲種 AMA1 氨基酸進(jìn)行多重基酸序列具有較高的相似性，EtMA1 與其他蟲種相似性在 17種相似性在 14-26%之間，通過構(gòu)建進(jìn)化樹分析，顯示 EtMA1化關(guān)系最為接近，EtMA2 與弓形蟲 TgAMA1 及新孢子蟲 NcA圖 1-4）。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[3]柔嫩艾美耳球蟲棒狀體頸部蛋白2基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及在293T細(xì)胞中表達(dá)[J]. 王曄,姜連連,韓紅玉,薛璞,趙其平,董輝,朱順海,舒凡帆,黃兵.  中國動物傳染病學(xué)報. 2012(05)
[4]犬新孢子蟲MAG1與IFN-γ融合基因重組真核質(zhì)粒的真核共表達(dá)及免疫學(xué)評價[J]. 焦石,賈立軍,張立霞,錢年超,劉明明,黃國明,張守發(fā).  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報. 2012(08)
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[6]微小隱孢子蟲三個基因主要抗原表位區(qū)的串聯(lián)表達(dá)及其抗原性分析[J]. 秦培蘭,李艷,米榮升,呼高偉,黃燕,周鵬,張國恩,蘇慶美,曹薇,陳兆國.  中國動物傳染病學(xué)報. 2012(03)
[7]柔嫩艾美耳球蟲Etron2基因在不同發(fā)育階段轉(zhuǎn)錄水平差異的分析[J]. 戚南山,孫銘飛,吳彩艷,廖申權(quán),呂敏娜,袁建豐,余勁術(shù),李祥瑞,蔡建平.  畜牧獸醫(yī)學(xué)報. 2012(04)
[8]柔嫩艾美耳球蟲棒狀體頸部蛋白EtRON2基因的克隆及序列分析[J]. 戚南山,孫銘飛,廖申權(quán),吳彩艷,呂敏娜,袁建豐,余勁術(shù),蔡建平,李祥瑞.  動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2011(12)
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本文編號：3419813