果糖二磷酸醛縮酶（FBA）是多種疫苗和藥物靶點,豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp）的強毒株和弱毒株的FBA的表達不同,故研究豬肺炎支原體FBA免疫特性對該病的防控有重要的意義。本試驗用原核表達系統(tǒng)表達了Mhp蛋白果糖1,6-二磷酸-D-醛縮酶（FBA）蛋白,并應用該重組蛋白免疫小鼠,利用Mhp全菌蛋白和FBA蛋白作為包被抗原對小鼠血清進行ELISA檢測,檢測了FBA抗原性。根據(jù)GenBank公布的Mhp FBA基因序列,利用軟件Primer5.0設計引物并合成,通過PCR擴增目的基因,測序發(fā)現(xiàn)864bp含有2個稀有密碼子,我們對前段90bp進行基因合成,剩余778bp通過SOE-PCR方法突變連接起來,插入到表達載體pET-28a（+）中,構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-28a（+）/FBA。將重組質(zhì)粒pET-28a（+）/FBA導入大腸桿菌BL21（DE3）進行表達,經(jīng)1%IPTG誘導表達5h后,蛋白的表達量最高,并用Protino Ni-TED2000Packed Columns進行親和純化,得到較純的目的蛋白。Western-blot結(jié)果分析證實原... 

【文章來源】：山西農(nóng)業(yè)大學山西省

【文章頁數(shù)】：49 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

重組蛋白的表達及存在形式分析

按說明書使用His標簽融合蛋白純化柱對表達產(chǎn)物進行純化，純化后進行SDS-PAGE純度分析，獲得大小為35 kDa的純蛋白，結(jié)果見圖1-8。后將分離純化重組蛋白進行半干式轉(zhuǎn)印法轉(zhuǎn)印至NC膜上，一抗為豬抗豬肺炎支原體髙免血清，二抗為羊抗豬IgG-HRP，DAB試劑盒顯色，結(jié)果證實，該蛋白能與豬Mhp高免豬血清發(fā)生特異性反應，見圖1-9。-24-

圖1-8純化后FBA蛋白SDS-PAGE 圖1-9 FBA蛋白的Westem-blot結(jié)果M:蛋白質(zhì)標準； M：預染的蛋白質(zhì)標準；1 ：純化后的FBA蛋白 1 ：純化后的FBA蛋白Fig l-8,The purification result of Fig 1-9 The result of Westem-blotrecombinant protein FBA M： Pre-Protein molecular weight markerM: Protein molecular weight marker； i： protein FBA after purification1 ： protein FBA after purification4討論當前國內(nèi)外有關(guān)于果糖1,6-二憐酸醛縮酶的研究報道不太多，主要是關(guān)于疫苗、斷及治療等方面。ScottD.Pegan[46]等對結(jié)合分支桿菌的FBA蛋白進行了表達純化，并

【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
[1]豬肺炎支原體168強弱毒株差異蛋白的篩選及鑒定[D]. 邱明君.山西農(nóng)業(yè)大學 2013
[2]豬肺炎支原體P97 C末端蛋白抗原表位分析及抗原捕捉ELISA方法初步研究[D]. 張美晶.中國農(nóng)業(yè)科學院 2010



本文編號：3416402