口蹄疫是一種針對偶蹄目家畜的、高度傳染性的疾病,它的致病源口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus, FMDV）的基因組是一條8300nt左右的正義RNA分子。在家畜飼養(yǎng)中,口蹄疫往往是一種急性的、短期的感染,但是家畜免疫系統(tǒng)有時不能完全根除病毒,從而產(chǎn)生一種輕微的的、持續(xù)的感染現(xiàn)象,稱之為持續(xù)感染。這種持續(xù)感染在一定條件下會引發(fā)大規(guī)模的急性感染。因此,研究口蹄疫病毒持續(xù)感染的機理對于疾病控制具有重要意義。本實驗室利用氯化銨處理FMDV感染的BHK-21細胞（敘利亞亞倉鼠腎細胞）建立了體外持續(xù)感染細胞模型,命名為PI（persistent infections）細胞。對持續(xù)感染建立機制的初步研究表明,氯化銨更傾向于改變宿主細胞的的性狀,使得BHK-21細胞更具有抵抗FMDV裂解性感染的能力,而病毒的裂解性感染能力并未改變。因此,要研究持續(xù)感染建立的機制,就必須從宿主細胞的角度出發(fā)。本研究首次運用跨物種雜交（CSH）芯片技術,將BHK-21細胞基因組轉錄物與人類全基因組表達譜芯片進行雜交。分別檢測急性感染細胞和持續(xù)感染細胞的全基因組表達譜情況（相對于正常BHK... 

【文章來源】：武漢大學湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
第一章 引言
    1.1 口蹄疫病毒流行病學簡介
        1.1.1 口蹄疫的歷史及其影響
        1.1.2 口蹄疫病毒
        1.1.3 臨床狀況
        1.1.4 持續(xù)感染和亞臨床感染
        1.1.5 口蹄疫病毒的進化和分子流行病學
    1.2 口蹄疫病毒持續(xù)感染的研究進展
        1.2.1 持續(xù)感染細胞的建立及機制的初步研究
        1.2.2 持續(xù)感染中病毒方面的研究進展
        1.2.3 持續(xù)感染中宿主細胞方面的研究進展
    1.3 交叉物種雜交(Cross-species hybridization,CSH)芯片技術
        1.3.1 簡介
        1.3.2 目標物種和芯片平臺之間的適用性
        1.3.3 CSH可以得到與SSH(種內(nèi)特異雜交)似的結果嗎?
        1.3.4 探針和轉錄物的匹配程度影響了CSH結果的質量
            1.3.4.1 CSH之中的信號降低
            1.3.4.2 CSH之中多余的交叉雜交
            1.3.4.3 CSH結果的重復性
        1.3.5 怎樣從CSH中得到準確的生物學結果?
            1.3.5.1 選擇芯片平臺,評價候選芯片平臺
            1.3.5.2 選擇芯片探針類型
            1.3.5.3 實驗設計
        1.3.6 小結
第二章 運用交叉物種雜交(CSH)芯片技術對FMDV持感細胞和急感細胞全基因組表達進行檢測
    2.1 引言
    2.2 材料和方法
        2.2.1 材料
        2.2.2 方法
            2.2.2.1 細胞培養(yǎng)及病毒感染、滴度測定
            2.2.2.2 急感、持感和正常BHK-21細胞的總RNA提取
            2.2.2.3 病毒RNA的提取及其RT-PCR實時熒光定量
            2.2.2.4 總RNA質量檢測及cDNA合成
            2.2.2.5 熒光標記cRNA合成
            2.2.2.6 芯片雜交、洗滌及掃描
    2.3 結果與分析
        2.3.1 野生FMDV滴度測定
            2.3.1.1 蝕斑法測定FMDV滴度
            2.3.1.2 TCID_(50)法測定FMDV滴度
        2.3.2 持感病毒與持感細胞的特性研究
            2.3.2.1 持感病毒形成CPE的能力
            2.3.2.2 持感細胞的抗病毒能力
        2.3.3 總RNA質量檢測
        2.3.4 表達譜芯片掃描圖片
        2.3.5 全基因組表達譜芯片數(shù)據(jù)
    2.4 討論
第三章 表達譜芯片結果的深入分析及熒光定量驗證
    3.1 引言
    3.2 材料和方法
        3.2.1 材料
        3.2.2 方法
            3.2.2.1 基因芯片數(shù)據(jù)分析
            3.2.2.2 急感、持感和正常BHK-21勸胞的樣品收集與RNA提取
            3.2.2.3 RT-PCR實時熒光定量
            3.2.2.4 基因克隆及其測序
    3.3 結果與分析
        3.3.1 芯片結果的初步分析(所有信號點表達值的整體分析)
            3.3.1.1 Box Plot(箱線圖分析基因表達的總體分布)
            3.3.1.2 MA Plot(雙通道信號整體強度和差值)
            3.3.1.3 Heat Map and Unsupervised Hierarchical Clustering(層次聚類分析)
            3.3.1.4 總結
        3.3.2 急感和持感的顯著差異表達基因的分析(相對于正常BHK-21細胞)
        3.3.3 Pathway分析
        3.3.4 找出共同變化的基因
        3.3.5 挑取基因進行熒光定量驗證
        3.3.6 定量基因的克隆測序結果
    3.4 討論
第四章 跨平臺雜交(cross-platform hybridization)芯片技術對持續(xù)感染細胞的進一步研究
    4.1 引言
    4.2 材料和方法
        4.2.1 材料
        4.2.2 方法
            4.2.2.1 急感、持感和正常BHK-21細胞的總RNA提取
            4.2.2.2 總RNA質量檢測及cDNA合成
            4.2.2.3 熒光標記cRNA合成
            4.2.2.4 芯片雜交、洗滌及掃描
    4.3 結果與分析
        4.3.1 收樣細胞以及總RNA質量檢測
        4.3.2 表達譜芯片掃描圖片
        4.3.3 全基因組表達譜芯片數(shù)據(jù)
        4.3.4 小鼠芯片檢測結果的初步分析
            4.3.4.1 Box Plot(箱線圖分析基因表達總體分布)
            4.3.4.2 MA Plot(雙通道信號整體強度和差值)
            4.3.4.3 Heat Map and Unsupervised Hierarchical Clustering(層次聚類分析)
            4.3.4.4 總結
        4.3.5 小鼠芯片和人類芯片全基因組表達譜結果的比較
        4.3.6 找出小鼠和人類芯片結果中共有的基因
    4.4 討論
全文總結
參考文獻
博士在讀期間發(fā)表和待發(fā)表的論文
致謝



本文編號：3405241