豬繁殖與呼吸綜合征最早流行于美國(guó),現(xiàn)在遍布全球,給全球的養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失,對(duì)該病的診斷與預(yù)防顯得尤為重要。該病的診斷方法很多,主要分為抗原檢測(cè)：PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR;抗體檢測(cè)：IFA、IPMA、SVN、EILSA。與其他方法做比較,ELISA方法更容易操作,用時(shí)短,敏感,適合用于進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查和疫苗免疫效果的評(píng)價(jià)。接種疫苗是預(yù)防與控制該病的主要手段,目前用于預(yù)防PRRS的常用疫苗是弱毒苗和滅活苗。弱毒疫苗雖然能提供較好的免疫保護(hù),但存在毒力返強(qiáng)的危險(xiǎn)。滅活疫苗不僅需多次重復(fù)接種,而且效果不穩(wěn)定,還經(jīng)常導(dǎo)致免疫失敗。目前迫切需要更加安全、有效的疫苗來(lái)預(yù)防和控制該病的發(fā)生與流行。PRRSV ORF5基因翻譯產(chǎn)生的GP5蛋白能誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生,在豬感染PRRSV后康復(fù)豬血清中的中和抗體主要作用GP5蛋白,因此GP5蛋白成為了PRRS新型疫苗和診斷試劑的較好靶蛋白。鑒于此,本課題研究了GP5蛋白的表達(dá),針對(duì)GP5蛋白的單克隆抗體的制備,PRRSV GP5-ELISA診斷方法的建立,以及PRRSV核酸疫苗的研究。1.GP5蛋白在大腸桿菌中的高效表達(dá)由于全長(zhǎng)ORF5基因在大腸桿菌中表達(dá)... 

【文章來(lái)源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語(yǔ)表（Abbreviation)
第1章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 豬繁殖與呼吸綜合征
    1.2 PRRSV病原特性
        1.2.1 PRRSV的分類及形態(tài)
        1.2.2 PRRSV的抗原性
    1.3 PRRSV分子生物學(xué)研究進(jìn)展
        1.3.1 PRRSV基因組結(jié)構(gòu)與功能
        1.3.2 PRRSV的蛋白質(zhì)
            1.3.2.1 主要結(jié)構(gòu)蛋白-GP5蛋白
    1.4 PRRS診斷方法研究進(jìn)展
        1.4.1 病原學(xué)診斷
        1.4.2 血清學(xué)診斷
    1.5 PRRS疫苗研究進(jìn)展
        1.5.1 PRRS常規(guī)疫苗
        1.5.2 PRRS新型疫苗
第2章 目的與意義
第3章 材料與方法
    3.1 試驗(yàn)材料
        3.1.1 細(xì)胞、毒株、菌株、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        3.1.2 載體
        3.1.3 工具酶及相關(guān)試劑
        3.1.4 培養(yǎng)基、抗生素及其配制
        3.1.5 相關(guān)緩沖液和試劑及其配制
        3.1.6 其它試劑與緩沖液
        3.1.7 血清
    3.2 試驗(yàn)方法
        3.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        3.2.2 病毒增值
        3.2.3 總RNA的提取
        3.2.4 限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)
        3.2.5 PCR產(chǎn)物或酶切產(chǎn)物的電泳檢測(cè)
        3.2.6 PCR產(chǎn)物或酶切產(chǎn)物回收與純化
        3.2.7 外源DNA片段與質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)
        3.2.8 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備(氯化鈣法)
        3.2.9 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
        3.2.10 質(zhì)粒的制備
        3.2.11 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染(脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法)
        3.2.12 Western blot檢測(cè)目的蛋白在真核細(xì)胞中的表達(dá)
        3.2.13 包涵體提取
        3.2.14 單抗的制備(徐志凱1992)
        3.2.15 GP5-ELISA方法的建立
        3.2.16 半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量(TCID_(50))的測(cè)定
        3.2.17 微量中和試驗(yàn)(固定病毒-稀釋血清法)
        3.2.18 細(xì)胞免疫的檢測(cè)
        3.2.19 動(dòng)物試驗(yàn)
        3.2.20 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
第4章 結(jié)果與分析
    4.1 抗GP5蛋白的單克隆抗體的制備
        4.1.1 PRRSV WUH3株的ORF5基因的RT-PCR擴(kuò)增
        4.1.2 GP5蛋白的原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定
        4.1.3 GP5蛋白的原核表達(dá)與純化
        4.1.4 重組GP5蛋白最佳包被濃度的確定
        4.1.5 免疫BALB/C小鼠血清效價(jià)的測(cè)定
        4.1.6 Western Blotting驗(yàn)證抗GP5蛋白單克隆抗體
        4.1.7 間接免疫熒光(IFA)驗(yàn)證抗GP5蛋白單克隆抗體
    4.2 PRRSV GP5-ELISA診斷方法的建立
        4.2.1 GP5-ELISA最佳條件的確定
        4.2.2 GP5-ELISA陰陽(yáng)界線的確定
        4.2.3 GP5-ELISA方法的交叉反應(yīng)性、重復(fù)性試驗(yàn)
        4.2.4 GP5-ELISA與國(guó)外試劑盒的對(duì)比試驗(yàn)
    4.3 PRRSV核酸疫苗的研究
        4.3.1 真核質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.3.2 Western blot檢測(cè)目的蛋白在Hela細(xì)胞中的表達(dá)
        4.3.3 動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果
第5章 討論與結(jié)論
    5.1 討論
        5.1.1 針對(duì)GP5蛋白的單克隆抗體制備
        5.1.2 PRRSV GP5-ELISA診斷方法的建立
        5.1.3 PRRSV核酸疫苗的研究
    5.2 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗的研制[J]. 郭致君,王文泉,關(guān)智慧,金衛(wèi)紅.  當(dāng)代畜牧. 2002(03)
[2]豬繁殖與呼吸綜合征病毒形態(tài)學(xué)特征[J]. 李成,李六金,谷守林,蔡虹,姜煥宏,趙世君,張海,李秦.  畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2001(06)
[3]豬繁殖與呼吸綜合征及其在我國(guó)的現(xiàn)狀與對(duì)策[J]. 蔡雪暉,柴文君,翁長(zhǎng)江,劉光清,郭寶清.  中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2000(S1)
[4]從疑似PRRS流產(chǎn)胎兒分離PRRSV的研究[J]. 郭寶清,陳章水,劉文興,崔益洙.  中國(guó)畜禽傳染病. 1996(02)

碩士論文
[1]PRRSV病毒樣顆粒的組裝與DNA疫苗研究[D]. 李楊.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2012
[2]PRRSV GP5蛋白與豬IL-18基因共表達(dá)核酸疫苗的構(gòu)建及免疫原性研究[D]. 高磊.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 2011
[3]PRRSV重組N蛋白ELISA檢測(cè)方法的建立及單克隆抗體的制備[D]. 李素平.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2009



本文編號(hào)：3404495