豬繁殖與呼吸綜合征最早流行于美國,現(xiàn)在遍布全球,給全球的養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失,對該病的診斷與預(yù)防顯得尤為重要。該病的診斷方法很多,主要分為抗原檢測：PCR、實時熒光定量PCR;抗體檢測：IFA、IPMA、SVN、EILSA。與其他方法做比較,ELISA方法更容易操作,用時短,敏感,適合用于進行流行病學調(diào)查和疫苗免疫效果的評價。接種疫苗是預(yù)防與控制該病的主要手段,目前用于預(yù)防PRRS的常用疫苗是弱毒苗和滅活苗。弱毒疫苗雖然能提供較好的免疫保護,但存在毒力返強的危險。滅活疫苗不僅需多次重復(fù)接種,而且效果不穩(wěn)定,還經(jīng)常導致免疫失敗。目前迫切需要更加安全、有效的疫苗來預(yù)防和控制該病的發(fā)生與流行。PRRSV ORF5基因翻譯產(chǎn)生的GP5蛋白能誘導中和抗體的產(chǎn)生,在豬感染PRRSV后康復(fù)豬血清中的中和抗體主要作用GP5蛋白,因此GP5蛋白成為了PRRS新型疫苗和診斷試劑的較好靶蛋白。鑒于此,本課題研究了GP5蛋白的表達,針對GP5蛋白的單克隆抗體的制備,PRRSV GP5-ELISA診斷方法的建立,以及PRRSV核酸疫苗的研究。1.GP5蛋白在大腸桿菌中的高效表達由于全長ORF5基因在大腸桿菌中表達... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：55 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語表（Abbreviation)
第1章 文獻綜述
    1.1 豬繁殖與呼吸綜合征
    1.2 PRRSV病原特性
        1.2.1 PRRSV的分類及形態(tài)
        1.2.2 PRRSV的抗原性
    1.3 PRRSV分子生物學研究進展
        1.3.1 PRRSV基因組結(jié)構(gòu)與功能
        1.3.2 PRRSV的蛋白質(zhì)
            1.3.2.1 主要結(jié)構(gòu)蛋白-GP5蛋白
    1.4 PRRS診斷方法研究進展
        1.4.1 病原學診斷
        1.4.2 血清學診斷
    1.5 PRRS疫苗研究進展
        1.5.1 PRRS常規(guī)疫苗
        1.5.2 PRRS新型疫苗
第2章 目的與意義
第3章 材料與方法
    3.1 試驗材料
        3.1.1 細胞、毒株、菌株、實驗動物
        3.1.2 載體
        3.1.3 工具酶及相關(guān)試劑
        3.1.4 培養(yǎng)基、抗生素及其配制
        3.1.5 相關(guān)緩沖液和試劑及其配制
        3.1.6 其它試劑與緩沖液
        3.1.7 血清
    3.2 試驗方法
        3.2.1 細胞培養(yǎng)
        3.2.2 病毒增值
        3.2.3 總RNA的提取
        3.2.4 限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)
        3.2.5 PCR產(chǎn)物或酶切產(chǎn)物的電泳檢測
        3.2.6 PCR產(chǎn)物或酶切產(chǎn)物回收與純化
        3.2.7 外源DNA片段與質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)
        3.2.8 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備(氯化鈣法)
        3.2.9 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
        3.2.10 質(zhì)粒的制備
        3.2.11 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染(脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染法)
        3.2.12 Western blot檢測目的蛋白在真核細胞中的表達
        3.2.13 包涵體提取
        3.2.14 單抗的制備(徐志凱1992)
        3.2.15 GP5-ELISA方法的建立
        3.2.16 半數(shù)細胞培養(yǎng)物感染量(TCID_(50))的測定
        3.2.17 微量中和試驗(固定病毒-稀釋血清法)
        3.2.18 細胞免疫的檢測
        3.2.19 動物試驗
        3.2.20 統(tǒng)計學方法
第4章 結(jié)果與分析
    4.1 抗GP5蛋白的單克隆抗體的制備
        4.1.1 PRRSV WUH3株的ORF5基因的RT-PCR擴增
        4.1.2 GP5蛋白的原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定
        4.1.3 GP5蛋白的原核表達與純化
        4.1.4 重組GP5蛋白最佳包被濃度的確定
        4.1.5 免疫BALB/C小鼠血清效價的測定
        4.1.6 Western Blotting驗證抗GP5蛋白單克隆抗體
        4.1.7 間接免疫熒光(IFA)驗證抗GP5蛋白單克隆抗體
    4.2 PRRSV GP5-ELISA診斷方法的建立
        4.2.1 GP5-ELISA最佳條件的確定
        4.2.2 GP5-ELISA陰陽界線的確定
        4.2.3 GP5-ELISA方法的交叉反應(yīng)性、重復(fù)性試驗
        4.2.4 GP5-ELISA與國外試劑盒的對比試驗
    4.3 PRRSV核酸疫苗的研究
        4.3.1 真核質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.3.2 Western blot檢測目的蛋白在Hela細胞中的表達
        4.3.3 動物試驗結(jié)果
第5章 討論與結(jié)論
    5.1 討論
        5.1.1 針對GP5蛋白的單克隆抗體制備
        5.1.2 PRRSV GP5-ELISA診斷方法的建立
        5.1.3 PRRSV核酸疫苗的研究
    5.2 結(jié)論
參考文獻
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗的研制[J]. 郭致君,王文泉,關(guān)智慧,金衛(wèi)紅.  當代畜牧. 2002(03)
[2]豬繁殖與呼吸綜合征病毒形態(tài)學特征[J]. 李成,李六金,谷守林,蔡虹,姜煥宏,趙世君,張海,李秦.  畜牧獸醫(yī)學報. 2001(06)
[3]豬繁殖與呼吸綜合征及其在我國的現(xiàn)狀與對策[J]. 蔡雪暉,柴文君,翁長江,劉光清,郭寶清.  中國預(yù)防獸醫(yī)學報. 2000(S1)
[4]從疑似PRRS流產(chǎn)胎兒分離PRRSV的研究[J]. 郭寶清,陳章水,劉文興,崔益洙.  中國畜禽傳染病. 1996(02)

碩士論文
[1]PRRSV病毒樣顆粒的組裝與DNA疫苗研究[D]. 李楊.華中農(nóng)業(yè)大學 2012
[2]PRRSV GP5蛋白與豬IL-18基因共表達核酸疫苗的構(gòu)建及免疫原性研究[D]. 高磊.吉林農(nóng)業(yè)大學 2011
[3]PRRSV重組N蛋白ELISA檢測方法的建立及單克隆抗體的制備[D]. 李素平.河南農(nóng)業(yè)大學 2009



本文編號：3404495