雞沙門(mén)菌病在我國(guó)仍然廣泛流行,嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)。外表健康的患雞容易向外排菌,使雞蛋、雞肉等產(chǎn)品遭受污染,給食品安全和公眾健康帶來(lái)一定的危險(xiǎn),容易造成人食物中毒。由于沙門(mén)菌感染后能終身帶菌,并可通過(guò)種蛋垂直傳給雛雞,因此鑒定并淘汰陽(yáng)性種雞十分必要。長(zhǎng)期以來(lái),養(yǎng)雞場(chǎng)一直使用玻板凝集試驗(yàn)檢測(cè)淘汰患雞白痢、雞傷寒的病雞,但是該方法敏感性有限,經(jīng)常漏檢。感染雞間歇性排毒或不排毒,使得傳統(tǒng)分菌的方法不夠敏感。感染性沙門(mén)菌血清型眾多,傳統(tǒng)ELISA方法不能滿(mǎn)足實(shí)際需求。沙門(mén)菌InvJ蛋白是廣泛存在于沙門(mén)菌中的保守蛋白,使用該蛋白檢測(cè)沙門(mén)菌抗體,可以有效地檢出被沙門(mén)菌感染的雞。因此,本試驗(yàn)采用分子克隆方法,得到InvJ蛋白,將其作為檢測(cè)抗原,研制出能檢測(cè)沙門(mén)菌InvJ抗體的間接ELISA方法,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。1.沙門(mén)菌InvJ基因的克隆與融合蛋白的表達(dá)同源性分析顯示沙門(mén)菌InvJ蛋白和其他細(xì)菌的蛋白同源性低,在沙門(mén)菌中是一個(gè)保守蛋白。根據(jù)Genbank （CP003047）上公布的雞傷寒／白痢沙門(mén)菌InvJ序列設(shè)計(jì)引物,成功在腸炎沙門(mén)菌標(biāo)準(zhǔn)株（CVCC3375）中擴(kuò)增得到InvJ基因,將該基因連接到p... 

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【文章頁(yè)數(shù)】：50 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
1 前言
    1.1 沙門(mén)菌屬簡(jiǎn)介
    1.2 沙門(mén)菌病及其流行情況
        1.2.1 人沙門(mén)菌病及其流行情況
        1.2.2 沙門(mén)菌對(duì)養(yǎng)雞場(chǎng)的危害及流行情況
    1.3 沙門(mén)菌病的診斷方法
        1.3.1 常規(guī)分離鑒定病原的方法
        1.3.2 玻板凝集試驗(yàn)檢測(cè)沙門(mén)菌抗體
        1.3.3 PCR技術(shù)檢測(cè)檢測(cè)沙門(mén)菌
        1.3.4 LAMP技術(shù)檢測(cè)沙門(mén)菌
        1.3.5 免疫磁珠技術(shù)
        1.3.6 免疫層析技術(shù)
        1.3.7 ELISA方法檢測(cè)沙門(mén)菌病
    1.4 沙門(mén)菌三型分泌系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、組成簡(jiǎn)介
    1.5 目的與意義
2 材料方法
    2.1 試驗(yàn)材料
        2.1.1 菌株、質(zhì)粒、血清
        2.1.2 儀器
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 主要溶液和培養(yǎng)基
    2.2 目的基因的選取及同源性分析
    2.3 目的基因的克隆與融合蛋白的表達(dá)
        2.3.1 目的基因的擴(kuò)增
        2.3.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.3.3 重組質(zhì)粒的鑒定
        2.3.4 重組蛋白表達(dá)產(chǎn)物的分析
        2.3.5 不同培養(yǎng)基、誘導(dǎo)劑對(duì)蛋白表達(dá)的影響
        2.3.6 重組蛋白的純化
        2.3.7 Western-Blot鑒定融合蛋白免疫活性
    2.4 沙門(mén)菌InvJ抗體間接ELISA檢測(cè)方法的建立
        2.4.1 重組抗原包被濃度及血清稀釋度的確定
        2.4.2 最佳抗原包被液的確定
        2.4.3 封閉液的確定
        2.4.4 封閉時(shí)間的優(yōu)化
        2.4.5 血清作用時(shí)間的優(yōu)化
        2.4.6 酶標(biāo)二抗作用時(shí)間的優(yōu)化
        2.4.7 顯色時(shí)間的優(yōu)化
        2.4.8 陰性臨界值的確定
    2.5 間接ELISA性能評(píng)價(jià)
        2.5.1 特異性試驗(yàn)
        2.5.2 重復(fù)性試驗(yàn)
    2.6 血清樣品的初步檢測(cè)
3 結(jié)果與分析
    3.1 蛋白選擇及同源性分析
    3.2 基因的克隆與表達(dá)
        3.2.1 目的基因的擴(kuò)增
        3.2.2 重組質(zhì)粒的鑒定
        3.2.3 重組蛋白表達(dá)產(chǎn)物的分析
        3.2.4 不同培養(yǎng)基、誘導(dǎo)劑對(duì)蛋白表達(dá)的影響
        3.2.5 重組蛋白的純化
        3.2.6 Western-Blot鑒定融合蛋白免疫活性
    3.3 沙門(mén)菌InvJ抗體間接ELISA檢測(cè)方法的建立
        3.3.1 重組抗原包被濃度和血清稀釋度的確定
        3.3.2 最佳抗原包被液的確定
        3.3.3 包被時(shí)間的確定
        3.3.4 封閉液的選擇
        3.3.5 封閉時(shí)間的優(yōu)化
        3.3.6 血清作用時(shí)間的優(yōu)化
        3.3.7 最佳血清稀釋液的選擇
        3.3.8 酶標(biāo)二抗作用時(shí)間的優(yōu)化
        3.3.9 顯色時(shí)間的優(yōu)化
        3.3.10 間接ELISA操作方法的確定
        3.3.11 陰性臨界值的確定
    3.4 間接ELISA可靠性試驗(yàn)
        3.4.1 特異性試驗(yàn)
        3.4.2 重復(fù)性試驗(yàn)
    3.5 血清樣品的初步檢測(cè)
4 討論
    4.1 目的蛋白的選取
    4.2 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
    4.4 間接ELISA檢測(cè)沙門(mén)菌抗體
5 試驗(yàn)結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號(hào)：3404103