雞沙門菌病在我國仍然廣泛流行,嚴重危害養(yǎng)雞業(yè)。外表健康的患雞容易向外排菌,使雞蛋、雞肉等產(chǎn)品遭受污染,給食品安全和公眾健康帶來一定的危險,容易造成人食物中毒。由于沙門菌感染后能終身帶菌,并可通過種蛋垂直傳給雛雞,因此鑒定并淘汰陽性種雞十分必要。長期以來,養(yǎng)雞場一直使用玻板凝集試驗檢測淘汰患雞白痢、雞傷寒的病雞,但是該方法敏感性有限,經(jīng)常漏檢。感染雞間歇性排毒或不排毒,使得傳統(tǒng)分菌的方法不夠敏感。感染性沙門菌血清型眾多,傳統(tǒng)ELISA方法不能滿足實際需求。沙門菌InvJ蛋白是廣泛存在于沙門菌中的保守蛋白,使用該蛋白檢測沙門菌抗體,可以有效地檢出被沙門菌感染的雞。因此,本試驗采用分子克隆方法,得到InvJ蛋白,將其作為檢測抗原,研制出能檢測沙門菌InvJ抗體的間接ELISA方法,現(xiàn)將結(jié)果報告如下。1.沙門菌InvJ基因的克隆與融合蛋白的表達同源性分析顯示沙門菌InvJ蛋白和其他細菌的蛋白同源性低,在沙門菌中是一個保守蛋白。根據(jù)Genbank （CP003047）上公布的雞傷寒／白痢沙門菌InvJ序列設計引物,成功在腸炎沙門菌標準株（CVCC3375）中擴增得到InvJ基因,將該基因連接到p... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：50 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
1 前言
    1.1 沙門菌屬簡介
    1.2 沙門菌病及其流行情況
        1.2.1 人沙門菌病及其流行情況
        1.2.2 沙門菌對養(yǎng)雞場的危害及流行情況
    1.3 沙門菌病的診斷方法
        1.3.1 常規(guī)分離鑒定病原的方法
        1.3.2 玻板凝集試驗檢測沙門菌抗體
        1.3.3 PCR技術檢測檢測沙門菌
        1.3.4 LAMP技術檢測沙門菌
        1.3.5 免疫磁珠技術
        1.3.6 免疫層析技術
        1.3.7 ELISA方法檢測沙門菌病
    1.4 沙門菌三型分泌系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、組成簡介
    1.5 目的與意義
2 材料方法
    2.1 試驗材料
        2.1.1 菌株、質(zhì)粒、血清
        2.1.2 儀器
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 主要溶液和培養(yǎng)基
    2.2 目的基因的選取及同源性分析
    2.3 目的基因的克隆與融合蛋白的表達
        2.3.1 目的基因的擴增
        2.3.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.3.3 重組質(zhì)粒的鑒定
        2.3.4 重組蛋白表達產(chǎn)物的分析
        2.3.5 不同培養(yǎng)基、誘導劑對蛋白表達的影響
        2.3.6 重組蛋白的純化
        2.3.7 Western-Blot鑒定融合蛋白免疫活性
    2.4 沙門菌InvJ抗體間接ELISA檢測方法的建立
        2.4.1 重組抗原包被濃度及血清稀釋度的確定
        2.4.2 最佳抗原包被液的確定
        2.4.3 封閉液的確定
        2.4.4 封閉時間的優(yōu)化
        2.4.5 血清作用時間的優(yōu)化
        2.4.6 酶標二抗作用時間的優(yōu)化
        2.4.7 顯色時間的優(yōu)化
        2.4.8 陰性臨界值的確定
    2.5 間接ELISA性能評價
        2.5.1 特異性試驗
        2.5.2 重復性試驗
    2.6 血清樣品的初步檢測
3 結(jié)果與分析
    3.1 蛋白選擇及同源性分析
    3.2 基因的克隆與表達
        3.2.1 目的基因的擴增
        3.2.2 重組質(zhì)粒的鑒定
        3.2.3 重組蛋白表達產(chǎn)物的分析
        3.2.4 不同培養(yǎng)基、誘導劑對蛋白表達的影響
        3.2.5 重組蛋白的純化
        3.2.6 Western-Blot鑒定融合蛋白免疫活性
    3.3 沙門菌InvJ抗體間接ELISA檢測方法的建立
        3.3.1 重組抗原包被濃度和血清稀釋度的確定
        3.3.2 最佳抗原包被液的確定
        3.3.3 包被時間的確定
        3.3.4 封閉液的選擇
        3.3.5 封閉時間的優(yōu)化
        3.3.6 血清作用時間的優(yōu)化
        3.3.7 最佳血清稀釋液的選擇
        3.3.8 酶標二抗作用時間的優(yōu)化
        3.3.9 顯色時間的優(yōu)化
        3.3.10 間接ELISA操作方法的確定
        3.3.11 陰性臨界值的確定
    3.4 間接ELISA可靠性試驗
        3.4.1 特異性試驗
        3.4.2 重復性試驗
    3.5 血清樣品的初步檢測
4 討論
    4.1 目的蛋白的選取
    4.2 融合蛋白的誘導表達
    4.4 間接ELISA檢測沙門菌抗體
5 試驗結(jié)論
參考文獻
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
[1]抗菌肽CAP18融合表達、條件優(yōu)化以及活性的初步鑒定[D]. 徐靈龍.東北農(nóng)業(yè)大學 2007



本文編號：3404103