發(fā)布時(shí)間：2021-09-18 12:17

　　豬德爾塔冠狀病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCoV）是近年來新出現(xiàn)的一種引起豬腹瀉的冠狀病毒。在2012年香港首次報(bào)道,2014年在美國豬群中檢出并迅速蔓延至美國20多個(gè)州和加拿大。以水樣腹瀉、嘔吐、脫水和死亡為主要臨床癥狀,給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。因此分離病毒并解析其在細(xì)胞傳代過程中的基因進(jìn)化特征和致病力差異將有助于PDCoV致弱的分子機(jī)制研究,對研制弱毒疫苗具有重大意義。本研究首先對PDCoV NH株在ST細(xì)胞傳代毒株的病毒滴度和噬斑大小進(jìn)行測定。結(jié)果表明隨著傳代次數(shù)增加,病毒滴度升高。低代次細(xì)胞毒產(chǎn)生的噬斑小,高代次細(xì)胞毒產(chǎn)生的噬斑大,NH株在細(xì)胞上傳代50次后形成的噬斑大小無明顯差異。利用19對引物對NH-P10、NH-P20、NH-P30、NH-P40、NH-P50、NH-P60、NH-P70、NH-P80、NH-P90、NH-P100、NH-P110、NHP120、NH-P130、NH-P140、NH-P150和NH-P160的全基因組進(jìn)行測序。結(jié)果表明NH株在細(xì)胞傳代過程中沒有發(fā)生堿基的缺失和插入,但是存在核苷酸和氨基酸突變。這些核苷酸和氨... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：54 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

PDCoV電鏡照片

P140、NH-P150和NH-P160細(xì)胞毒稀釋成10-1.0～10-9.0個(gè)稀釋度。2）棄去96孔板中的維持液并用PBS洗2遍，甩干殘液。3）每孔加入100μl稀釋好的病毒液，每個(gè)稀釋度做8個(gè)重復(fù)，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察結(jié)果。4）在顯微鏡下觀察并記錄不同稀釋度下產(chǎn)生CPE的孔數(shù)，根據(jù)Reed-Muench方法計(jì)算不同代次的病毒滴度。2.3結(jié)果2.3.1全基因組分段擴(kuò)增結(jié)果采用RT-PCR方法對NH株細(xì)胞傳代毒每隔10代進(jìn)行全基因組測序，每個(gè)代次獲得了19個(gè)片段，且片段大小與理論值一致，以NH-P20和NH-P100為例（圖2-1和圖2-2）。圖2-1PCR分段擴(kuò)增NH-P20全基因電泳圖Fig.2-1ElectrophoresisresultsofRT-PCRproductsofNH-P20completegenomesequenceM:2000bpMarker;F1-F19分別表示每對引物擴(kuò)增片段LaneM:representsthe2000bpDNAladder;LaneF1-F19:representsthefragementamplifiedbyeachprimer,respectively

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第二章PDCoV不同代次毒株的全基因組測序分析14圖2-2PCR分段擴(kuò)增NH-P100全基因電泳圖Fig.2-2ElectrophoresisresultsofRT-PCRproductsofNH-P100completegenomesequenceM:2000bpMarker;F1-F19:分別表示每對引物擴(kuò)增片段LaneM:representsthe2000bpDNAladder;F1-F19:representsthefragementamplifiedbyeachprimer,respectively2.3.2不同代次全基因組序列分析將用19對引物擴(kuò)增并測序后的全基因組序列進(jìn)行比對拼接后共獲得關(guān)于NH株細(xì)胞傳代毒的17個(gè)全基因組序列。NH分離株序列除去3’端的Poly（A）尾，全長25420bp�；蚪M的結(jié)構(gòu)順序?yàn)?’UTR-S-E-M-ORF5-N-ORF7-3’UTR，其中5’UTR的堿基數(shù)為540bp，ORF1堿基數(shù)為18803bp，S堿基數(shù)為3480bp，E堿基數(shù)為252bp，M堿基數(shù)為654bp，ORF5堿基數(shù)為285bp，N堿基數(shù)為1029bp，ORF7堿基數(shù)為603bp和3’UTR堿基數(shù)為392bp。不同代次細(xì)胞毒全基因組測序結(jié)果表明NH株在細(xì)胞傳代過程中沒有發(fā)生插入和缺失。2.3.3全基因組序列的遺傳演化分析從Genbank下載了17個(gè)PDCoV毒株的全基因組序列，使用MEGA6.06軟件中的NJ法對NH株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。從圖2-3可以看出中國PDCoV參考毒株在同一群內(nèi)且親緣關(guān)系近，而與美國，韓國，越南株不在同一群內(nèi)且親緣關(guān)系遠(yuǎn)。NH株與國內(nèi)外參考株相比在5’UTR都有1個(gè)獨(dú)特的核苷酸插入（150C151）。在19478-19480位連續(xù)3個(gè)核苷酸AAT缺失，這種缺失現(xiàn)象也出現(xiàn)在除PDCoVCHN/AH/2004和HKU15-44外的中國PDCoV毒株中,這可能是區(qū)分中國PDCoV毒株與其他國家PDCoV毒株的標(biāo)志。NH株與其他參考株核苷酸比對發(fā)現(xiàn)全基因組中共有55個(gè)核苷酸為NH株特有。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號：3400124