該研究旨在構(gòu)建含人FSH基因的重組腺病毒載體,在山羊乳腺上皮細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá),驗(yàn)證重組人FSH的體外生物學(xué)活性。利用AdEasy重組腺病毒系統(tǒng)獲得pAdEasy-FSH/His重組腺病毒載體,經(jīng)HEK293A細(xì)胞包裝、擴(kuò)增后獲得重組人FSH腺病毒,感染GMEC后,檢測(cè)FSH表達(dá)情況。結(jié)果表明,將獲得的較高滴度的含F(xiàn)SH目的基因的重組腺病毒感染GMEC后,經(jīng)Western blot檢測(cè)GMEC細(xì)胞可以成功表達(dá)FSH蛋白;通過(guò)體外細(xì)胞活性試驗(yàn)驗(yàn)證其具備生物學(xué)活性。綜上所述,腺病毒介導(dǎo)的羊乳腺上皮細(xì)胞表達(dá)的重組人FSH具備體外生物學(xué)活性,這為進(jìn)一步在大動(dòng)物乳腺表達(dá)重組FSH奠定了基礎(chǔ)。 

【文章來(lái)源】：家畜生態(tài)學(xué)報(bào). 2020,41(10)北大核心

【文章頁(yè)數(shù)】：6 頁(yè)

【部分圖文】：

pAdTrack-CMV-FSH/His穿梭載體的構(gòu)建及鑒定

將重組腺病毒載體用PacI酶線性化后用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染到HEK 293A細(xì)胞中,3 d后在熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá),6 d后綠色熒光表達(dá)量明顯增加,9 d后細(xì)胞出現(xiàn)大量彗星狀綠色熒光,13 d時(shí)有50%細(xì)胞從培養(yǎng)瓶底脫落,細(xì)胞成葡萄球形狀,此時(shí)可以收集P1代病毒,細(xì)胞感染腺病毒效果如圖3所示。用第一代病毒繼續(xù)感染HEK 293A細(xì)胞得到第二代和第三代腺病毒,第三代腺病毒具有較高的病毒滴度,可以用來(lái)感染GMEC細(xì)胞細(xì)胞。用LaSRT法測(cè)定測(cè)定第三代病毒滴度,如圖4所示,隨著孔數(shù)的增加,綠色熒光逐漸變暗,即隨著病毒濃度的降低,熒光逐漸減少。重組腺病毒在第8個(gè)孔時(shí),綠色熒光數(shù)不足5個(gè),并且在第9個(gè)孔后完全黑暗,因此計(jì)算病毒滴度為1×109 PFU/mL。圖3 HEK-293A 細(xì)胞包裝P1代重組人FSH腺病毒(40×)

HEK-293A 細(xì)胞包裝P1代重組人FSH腺病毒(40×)

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器相關(guān)技術(shù)及研究進(jìn)展[J]. 梁振鑫,尹富強(qiáng),劉慶友,李力.  中國(guó)生物工程雜志. 2015(02)
[2]FSH研究進(jìn)展[J]. 華榮茂,曾斌.  江西科技師范大學(xué)學(xué)報(bào). 2014(06)
[3]長(zhǎng)效卵泡刺激素研究進(jìn)展[J]. 高麗婷,周莉婷,王俊玲,高向東,吳彥卓,徐明波.  中國(guó)新藥雜志. 2014(20)
[4]重組人卵泡刺激素的研究進(jìn)展[J]. 曹敏,王俊玲,吳彥卓,徐明波,姚文兵.  藥物生物技術(shù). 2014(01)
[5]重組人促卵泡激素研究進(jìn)展[J]. 劉金釧,彭貴子,盧智俊,左聯(lián).  中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào). 2013(03)
[6]人卵泡抑素基因真核表達(dá)載體構(gòu)建和體外表達(dá)[J]. 莫毅,梁方方,檀大羨,牛向麗,陳自洪,華榮,張海英,謝丹尼.  中國(guó)計(jì)劃生育學(xué)雜志. 2011(04)
[7]卵泡刺激素（FSH）的研究進(jìn)展[J]. 任春明,字向東,張重慶,楊其沅.  畜禽業(yè). 2006(20)

碩士論文
[1]重組人促卵泡生長(zhǎng)素的表達(dá)及其功能分析[D]. 華榮茂.江西科技師范大學(xué) 2016



本文編號(hào)：3390891