該研究旨在構(gòu)建含人FSH基因的重組腺病毒載體,在山羊乳腺上皮細胞中進行表達,驗證重組人FSH的體外生物學(xué)活性。利用AdEasy重組腺病毒系統(tǒng)獲得pAdEasy-FSH/His重組腺病毒載體,經(jīng)HEK293A細胞包裝、擴增后獲得重組人FSH腺病毒,感染GMEC后,檢測FSH表達情況。結(jié)果表明,將獲得的較高滴度的含F(xiàn)SH目的基因的重組腺病毒感染GMEC后,經(jīng)Western blot檢測GMEC細胞可以成功表達FSH蛋白;通過體外細胞活性試驗驗證其具備生物學(xué)活性。綜上所述,腺病毒介導(dǎo)的羊乳腺上皮細胞表達的重組人FSH具備體外生物學(xué)活性,這為進一步在大動物乳腺表達重組FSH奠定了基礎(chǔ)。 

【文章來源】：家畜生態(tài)學(xué)報. 2020,41(10)北大核心

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

pAdTrack-CMV-FSH/His穿梭載體的構(gòu)建及鑒定

將重組腺病毒載體用PacI酶線性化后用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染到HEK 293A細胞中,3 d后在熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光蛋白的表達,6 d后綠色熒光表達量明顯增加,9 d后細胞出現(xiàn)大量彗星狀綠色熒光,13 d時有50%細胞從培養(yǎng)瓶底脫落,細胞成葡萄球形狀,此時可以收集P1代病毒,細胞感染腺病毒效果如圖3所示。用第一代病毒繼續(xù)感染HEK 293A細胞得到第二代和第三代腺病毒,第三代腺病毒具有較高的病毒滴度,可以用來感染GMEC細胞細胞。用LaSRT法測定測定第三代病毒滴度,如圖4所示,隨著孔數(shù)的增加,綠色熒光逐漸變暗,即隨著病毒濃度的降低,熒光逐漸減少。重組腺病毒在第8個孔時,綠色熒光數(shù)不足5個,并且在第9個孔后完全黑暗,因此計算病毒滴度為1×109 PFU/mL。圖3 HEK-293A 細胞包裝P1代重組人FSH腺病毒(40×)

HEK-293A 細胞包裝P1代重組人FSH腺病毒(40×)

【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號：3390891