本論文旨在研究miRNA對(duì)脂肪細(xì)胞分化的影響,探討miRNA調(diào)控脂肪細(xì)胞分化和脂肪形成的分子機(jī)制。我們以5月齡大白豬和梅山豬的背部脂肪組織為研究對(duì)象,分別構(gòu)建背部脂肪組織的小RNA文庫(kù),應(yīng)用高通量的Solexa測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)分析軟件鑒定大白豬和梅山豬背部脂肪組織的miRNAs,并進(jìn)行差異表達(dá)和預(yù)測(cè)新的miRNAs等一系列分析。對(duì)這些差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行了鑒定、靶基因預(yù)測(cè)和功能分析,從中篩選與脂肪細(xì)胞分化、脂肪形成和脂肪代謝潛在相關(guān)的miRNAs。預(yù)測(cè)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-135a和miR-183可能通過(guò)調(diào)控經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路來(lái)影響脂肪的形成。據(jù)此,本研究通過(guò)合成寡核苷酸片段miRNA mimics和miRNA inhibitor分別模擬“功能獲得”和“功能缺失”來(lái)研究miRNAs對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞的甘油三酯含量和分化標(biāo)記基因表達(dá)水平的影響,并通過(guò)雙熒素酶報(bào)告基因檢測(cè)、QPCR及Western blotting分析來(lái)證實(shí)預(yù)測(cè)的靶基因。最后,通過(guò)生物信息學(xué)軟件對(duì)小鼠miR-183的側(cè)翼序列進(jìn)行預(yù)測(cè)、分離并克隆其核心啟動(dòng)子、ChiP-PCR試驗(yàn)證實(shí)GATA... 

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
中英文縮寫(xiě)對(duì)照表
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 引言
    2 脂肪形成概述
    3 WNT信號(hào)通路調(diào)控脂肪形成的研究進(jìn)展
        3.1 WNT信號(hào)通路及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)
        3.2 WNT信號(hào)通路調(diào)控脂肪形成
    4 miRNA調(diào)控脂肪細(xì)胞分化的研究進(jìn)展
        4.1 miRNA的發(fā)現(xiàn)、生物合成及作用機(jī)制
        4.2 miRNA參與調(diào)控脂肪細(xì)胞的分化過(guò)程
    5 miRNA調(diào)控WNT信號(hào)通路影響脂肪形成的研究進(jìn)展
    6 miRNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控
    7 目的與意義
第二章 豬背部皮下脂肪組織小RNA文庫(kù)的構(gòu)建及Solexa測(cè)序
    前言
    1 材料與方法
        1.1 試驗(yàn)動(dòng)物以及樣品采集
        1.2 主要試劑和儀器
        1.3 組織總RNA的提取
        1.4 小RNA文庫(kù)的構(gòu)建、Solexa高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)分析
            1.4.1 試驗(yàn)流程
            1.4.2 信息分析流程
            1.4.3 初級(jí)生物信息學(xué)分析
            1.4.4 高級(jí)生物信息學(xué)分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 總RNA樣品的質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果
        2.2 Solexa高通量測(cè)序結(jié)果的生物信息學(xué)分析
            2.2.1 大白豬和梅山豬小RNA庫(kù)的測(cè)序結(jié)果數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
            2.2.2 小RNA的分類(lèi)注釋
            2.2.3 已知miRNAs的表達(dá)量分析
            2.2.4 miRNA“種子”序列的堿基編輯
            2.2.5 豬新的候選miRNA的鑒定分析和mirna基因的聚類(lèi)分析
    3 討論
    4 小結(jié)
第三章 豬背部皮下脂肪組織miRNA的表達(dá)分析及功能預(yù)測(cè)
    前言
    1 材料與方法
        1.1 試驗(yàn)動(dòng)物以及樣品采集
        1.2 主要試劑和儀器
        1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成
        1.4 組織總RNA的提取
        1.5 RNA的反轉(zhuǎn)錄
            1.5.1 cDNA第一鏈的合成
            1.5.2 普通PCR反應(yīng)
            1.5.3 瓊脂糖凝膠電泳和成像
        1.6 Stem-loop QPCR驗(yàn)證
        1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
        1.8 miRNA的靶基因預(yù)測(cè)及功能分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 普通PCR和stem-loop QPCR驗(yàn)證結(jié)果
        2.2 miRNA的靶基因預(yù)測(cè)及功能分析
    3 討論
    4 小結(jié)
第四章 miR-135a和miR-183對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化及脂肪形成的影響
    前言
    1 材料與方法
        1.1 主要試劑和儀器
        1.2 主要溶液的配制
        1.3 miR-135a和miR-183寡核苷酸的轉(zhuǎn)染及3T3-L1前脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化
        1.4 細(xì)胞總RNA的提取
        1.5 QPCR分析
        1.6 油紅O染色及吸光度值分析
        1.7 甘油三酯含量測(cè)定
        1.8 預(yù)測(cè)靶基因3'UTR載體及其突變載體的構(gòu)建
        1.9 靶基因的鑒定
        1.10 經(jīng)典WNT信號(hào)通路相關(guān)基因及蛋白質(zhì)的檢測(cè)
        1.11 Western blotting分析
        1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 miR-135a對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化及脂肪形成的影響
            2.1.1 miR-135a在3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中下調(diào)表達(dá)
            2.1.2 超表達(dá)miR-135a抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化
            2.1.3 miR-135a靶基因的鑒定及其潛在調(diào)控機(jī)制
        2.2 miR-183對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化及脂肪形成的影響
            2.2.1 miR-183促進(jìn)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化
            2.2.2 miR-183靶基因的鑒定及其潛在調(diào)控機(jī)制
    3 討論
    4 小結(jié)
第五章 小鼠mir-183啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性研究
    前言
    1 材料與方法
        1.1 主要試劑及儀器
        1.2 生物信息學(xué)分析
        1.3 啟動(dòng)子片段的擴(kuò)增及載體構(gòu)建
        1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
        1.5 細(xì)胞總RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄、QPCR及Western blotting分析
        1.6 ChIP-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子GATA3與mir-183啟動(dòng)子的結(jié)合
        1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 mmu-mir-183轉(zhuǎn)錄規(guī)律的預(yù)測(cè)
        2.2 mmu-mir-183啟動(dòng)子區(qū)域載體構(gòu)建及熒光活性分析
        2.3 mmu-mir-183 promoter 2缺失片段載體構(gòu)建及熒光活性分析
        2.4 mmu-mir-183核心啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合預(yù)測(cè)及其試驗(yàn)驗(yàn)證
        2.5 轉(zhuǎn)錄因子GATA3對(duì)成熟miR-183表達(dá)量的影響及其機(jī)制研究
    3 討論
    4 小結(jié)
主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)
進(jìn)一步的研究?jī)?nèi)容
參考文獻(xiàn)
在讀期間發(fā)表論文題錄
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]脂肪細(xì)胞分化相關(guān)miRNA-hsa-miR-378生物信息學(xué)分析[J]. 徐露蓮,史春梅,陳玲,季晨博,郭錫熔,徐美玉.  中國(guó)兒童保健雜志. 2012(11)
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博士論文
[1]宰前應(yīng)激對(duì)豬肉質(zhì)的影響及其機(jī)制研究[D]. 柴進(jìn).華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2010

碩士論文
[1]miR-196a對(duì)豬脂肪細(xì)胞增殖分化的影響[D]. 寧小敏.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2010



本文編號(hào)：3390503