為了在雞基因組上對(duì)AMHR2基因進(jìn)行精確編輯,該研究利用crispr.mit.edu:807網(wǎng)站設(shè)計(jì)并通過(guò)PCR退火擬合獲得成對(duì)的AMHR2基因靶位點(diǎn),將靶位點(diǎn)分別整合進(jìn)pX330-U6-Chimeric_dBsa I-CBh-hSpCas9載體骨架,構(gòu)建靶向AMHR2基因的成對(duì)CRISPR/Cas9敲除載體。將包含成對(duì)靶位點(diǎn)的DNA序列整合進(jìn)pB-CMV-DsRed-CAG-Chimeric.200 bp repeat.Puro-T2A-GFP載體骨架,構(gòu)建與敲除載體對(duì)應(yīng)的雙熒光報(bào)告載體。載體測(cè)序鑒定正確后分別共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞與雞DF-1細(xì)胞,通過(guò)細(xì)胞熒光粗略判斷CRISPR/Cas9系統(tǒng)是否工作。隨后,利用Puromycin對(duì)基因編輯陽(yáng)性的DF-1細(xì)胞進(jìn)行藥物篩選富集,提取細(xì)胞基因組進(jìn)行TA克隆,進(jìn)一步檢測(cè)CRISPR/Cas9系統(tǒng)的工作效率。結(jié)果表明靶向雞AMHR2基因的CRISPR/Cas9敲除系統(tǒng)構(gòu)建成功,且成對(duì)靶位點(diǎn)敲除系統(tǒng)的工作效率高于單一靶位點(diǎn)敲除系統(tǒng),CRISPR/Cas9敲除系統(tǒng)在DF-1細(xì)胞基因組上對(duì)AMHR2基因的敲除效率約為60.0... 

【文章來(lái)源】：家畜生態(tài)學(xué)報(bào). 2020,41(06)北大核心

【文章頁(yè)數(shù)】：7 頁(yè)

【部分圖文】：

報(bào)告載體水平的HEK293T細(xì)胞AMHR2基因敲除效率

試驗(yàn)組DF-1細(xì)胞在Puromycin藥物篩選140 h后被收集提取細(xì)胞基因組DNA。為了進(jìn)一步檢測(cè)敲除載體的工作效率,對(duì)細(xì)胞基因組進(jìn)行TA克隆檢測(cè)。菌落成型后隨機(jī)選取20個(gè)菌落挑單克隆進(jìn)行菌落PCR初步鑒定,圖7中有約500 bp的條帶則為陽(yáng)性TA克隆。隨機(jī)選擇10個(gè)陽(yáng)性克隆(圖7中)進(jìn)行測(cè)序,結(jié)果如圖8所示,DF-1細(xì)胞基因組中AMHR2基因的突變率約為60.0%(6/10),所有檢測(cè)到的基因突變類型均為堿基缺失。3 討 論

基因編輯是研究基因功能的重要方法之一,CRISPR/Cas9技術(shù)相較于ZFN和TALEN技術(shù)具有簡(jiǎn)單高效的特點(diǎn),自發(fā)現(xiàn)以來(lái)在哺乳動(dòng)物上有廣泛應(yīng)用[15-17]。CRISPR/Cas9技術(shù)在雞中也有成功應(yīng)用但仍處于初步階段。2015年,Véron[12]對(duì)雞胚的PAX7基因進(jìn)行了敲除,首次實(shí)現(xiàn)了在雞基因組上的編輯應(yīng)用。然而,CRISPR/Cas9在雞細(xì)胞中的應(yīng)用存在著靶位點(diǎn)突變效率低的問(wèn)題[18]。Cas9核酸酶對(duì)靶位點(diǎn)的特異切割是基于sgRNA能夠準(zhǔn)確識(shí)別目的基因的靶位點(diǎn),但由于生物體的基因組極為復(fù)雜,sgRNA可能會(huì)與非靶位點(diǎn)進(jìn)行錯(cuò)配,導(dǎo)致脫靶效應(yīng)[19]。因此CRISPR/Cas9系統(tǒng)的靶位點(diǎn)的設(shè)計(jì)非常重要,有研究表明sgRNA的GC含量越高,對(duì)靶位點(diǎn)的切割效率越高[20]。為了利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)雞的AMHR2基因進(jìn)行特異敲除,首先應(yīng)構(gòu)建高效特異的Cas9敲除表達(dá)載體。不同于之前研究中對(duì)單一靶位點(diǎn)進(jìn)行打靶的敲除系統(tǒng),本研究通過(guò)crispr.mit.edu:807網(wǎng)站設(shè)計(jì)了位于雞AMHR2基因第二外顯子上的成對(duì)sgRNA靶位點(diǎn),以期提高對(duì)AMHR2基因的打靶效率。圖8 陽(yáng)性DF-1細(xì)胞基因組的測(cè)序分析


本文編號(hào)：3383396