豬流行性腹瀉（PED）是由豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起豬的一種急性腸道傳染病,主要導(dǎo)致感染豬的腹瀉、嘔吐及脫水癥狀,對(duì)哺乳仔豬有很高的致死率,給世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的比較常用的PEDV診斷方法有免疫熒光、ELISA、免疫組化、RT-PCR等,但是這些方法操作費(fèi)時(shí)且特異性、靈敏度不高,而且不能對(duì)疾病作出早期診斷,而熒光定量PCR則能夠彌補(bǔ)這些缺陷,且可進(jìn)行高通量檢測(cè)。PEDV是有囊膜的單股正鏈RNA病毒,其基因組中的M基因特別保守,通常被用來(lái)作為檢測(cè)方法的靶基因。我們參考GenBank中已經(jīng)公布的PEDV CV777株,設(shè)計(jì)出擴(kuò)增M基因全長(zhǎng)的特異性引物,另外設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物及TaqMan探針,擴(kuò)增長(zhǎng)度為196bp的片段。利用RT-PCR技術(shù),從陽(yáng)性病料中擴(kuò)增出681bp的M基因,序列比對(duì)結(jié)果表明,M基因序列與CV777株相應(yīng)M序列的同源性高達(dá)98%,并且與已經(jīng)發(fā)布的其它PEDV毒株的M基因序列相比,同源性也均在97%以上。我們將M基因克隆進(jìn)pMD18-T載體中,將鑒定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度系列稀釋以作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品,從而建立了一種快速檢測(cè)PEDV含量的Taq... 

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語(yǔ)表
第一章 前言
    1.1 PEDV病原結(jié)構(gòu)
    1.2 PEDV基因組結(jié)構(gòu)
    1.3 PED流行病學(xué)
    1.4 PED臨床癥狀
    1.5 PED病理變化
    1.6 PED致病機(jī)理
    1.7 PED診斷方法
    1.8 研究目的與意義
第二章 豬流行性腹瀉病毒TaqMan熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 病毒、質(zhì)粒與菌株
        2.1.2 主要實(shí)驗(yàn)器材
        2.1.3 主要試劑和藥品
        2.1.4 主要培養(yǎng)基和緩沖液的配制
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 熒光定量引物與探針的設(shè)計(jì)
        2.2.2 核酸的提取
        2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的制備
        2.2.4 熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
        2.2.5 特異性實(shí)驗(yàn)
        2.2.6 敏感性實(shí)驗(yàn)
        2.2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)
        2.2.8 臨床樣本的檢測(cè)
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 PEDV M片段的擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的鑒定
        2.3.2 熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
        2.3.3 特異性實(shí)驗(yàn)
        2.3.4 敏感性實(shí)驗(yàn)
        2.3.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)
        2.3.6 臨床樣本的檢測(cè)
    2.4 討論
第三章 PEDV變異株致病性的初步研究
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 病毒、抗體與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        3.1.2 主要實(shí)驗(yàn)器材
        3.1.3 主要試劑和藥品
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 攻毒病料的處理及熒光定量RT-PCR檢測(cè)
        3.2.2 攻毒實(shí)驗(yàn)
        3.2.3 熒光定量RT-PCR檢測(cè)糞便及組織
        3.2.4 組織切片的制作
        3.2.5 HE染色
        3.2.6 免疫組化
    3.3 結(jié)果及分析
        3.3.1 攻毒病料的熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果
        3.3.2 臨床癥狀及病理變化
        3.3.3 糞便的排毒規(guī)律
        3.3.4 病理組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果
        3.3.5 免疫組化檢測(cè)結(jié)果
    3.4 討論
第四章 全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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