喹烯酮（Quinocetone）屬喹噁啉-1,4-二氧化物,是我國首創(chuàng)的一類新獸藥,具有抗菌、止瀉和促生長作用,目前己廣泛應(yīng)用于養(yǎng)豬業(yè)中。同類藥物中的卡巴氧和喹乙醇由于具有遺傳毒性和潛在的致癌作用,己被世界上許多國家禁止或限用做動物飼料添加劑。具有相同母核結(jié)構(gòu)的喹烯酮體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均顯示出一定的遺傳毒性,但其毒性作用機(jī)理仍不清楚。本研究以體外培養(yǎng)的具有代謝酶活性的人肝癌HepG2細(xì)胞為模型,研究喹烯酮的細(xì)胞毒性作用及其產(chǎn)生機(jī)制,分析喹烯酮對HepG2細(xì)胞全基因組表達(dá)譜的影響,探討喹烯酮誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的分子調(diào)控機(jī)理,為評估喹烯酮對食品動物和人的安全性提供理論依據(jù)。MTT試驗(yàn)結(jié)果表明喹烯酮能抑制HepG2細(xì)胞的增殖,24h和48h的IC50值分別為9.2μg/ml和6.7μg/ml。LDH釋放試驗(yàn)顯示喹烯酮能促使HepG2釋放乳酸脫氫酶。流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)喹烯酮對HepG2細(xì)胞具有顯著的周期阻滯作用,低濃度喹烯酮使細(xì)胞阻滯于S期,高濃度時阻滯于Go/G1期。普通光學(xué)顯微鏡觀察、Hoechst33342/PI染色觀察及Annexin V-FITC/PI雙染法流式檢測結(jié)果表明喹烯酮能夠誘導(dǎo)... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)北京市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
目錄
圖表目錄
縮略詞表
第一章 緒論
    1.1 喹烯酮
        1.1.1 基本概況
        1.1.2 毒性作用
    1.2 細(xì)胞凋亡
        1.2.1 細(xì)胞凋亡概述
        1.2.2 細(xì)胞凋亡的分子信號通路
        1.2.3 細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制
    1.3 研究目的和意義
第二章 喹烯酮致HepG2細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用
    2.1 引言
    2.2 材料
        2.2.1 藥物
        2.2.2 細(xì)胞株
        2.2.3 試劑盒
        2.2.4 主要試劑
        2.2.5 主要儀器
    2.3 方法
        2.3.1 溶液配制
        2.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)
        2.3.3 細(xì)胞存活率測定(MTT法)
        2.3.4 乳酸脫氫酶法細(xì)胞毒性檢測(LDH釋放檢測試驗(yàn))
        2.3.5 細(xì)胞周期分布檢測
        2.3.6 細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察
        2.3.7 Annexin V-FITC/PI雙染法定量檢測細(xì)胞凋亡
        2.3.8 細(xì)胞自噬的形態(tài)學(xué)觀察
        2.3.9 細(xì)胞自噬的流式細(xì)胞儀檢測
        2.3.10 數(shù)據(jù)分析
    2.4 結(jié)果與分析
        2.4.1 喹烯酮抑制HepG2細(xì)胞的生長
        2.4.2 喹烯酮對HepG2細(xì)胞膜完整性的影響
        2.4.3 喹烯酮對HepG2細(xì)胞周期分布的影響
        2.4.4 喹烯酮誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡
        2.4.5 喹烯酮誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生自噬
    2.5 討論
        2.5.1 HepG2細(xì)胞模型
        2.5.2 喹烯酮的細(xì)胞毒性作用
        2.5.3 喹烯酮誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯
        2.5.4 喹烯酮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡
        2.5.5 喹烯酮誘導(dǎo)細(xì)胞自噬
    2.6 小結(jié)
第三章 喹烯酮致HepG2細(xì)胞毒性作用機(jī)制初探
    3.1 引言
    3.2 材料
        3.2.1 藥物
        3.2.2 細(xì)胞株
        3.2.3 抗體
        3.2.4 試劑盒
        3.2.5 主要試劑
        3.2.6 主要儀器
    3.3 方法
        3.3.1 溶液配制
        3.3.2 細(xì)胞內(nèi)ROS水平的測定
        3.3.3 8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)含量測定
        3.3.4 細(xì)胞存活率檢測
        3.3.5 細(xì)胞凋亡檢測
        3.3.6 線粒體膜電位(△ψ_m)檢測
        3.3.7 Western Blot檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)
        3.3.8 數(shù)據(jù)分析
    3.4 結(jié)果與分析
        3.4.1 喹烯酮對HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響
        3.4.2 喹烯酮對細(xì)胞內(nèi)8-OHdG含量的影響
        3.4.3 NAC對細(xì)胞存活率的影響
        3.4.4 NAC對細(xì)胞凋亡的影響
        3.4.5 NAC對線粒體膜電位改變的影響
        3.4.6 NAC對凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
    3.5 討論
        3.5.1 氧化應(yīng)激反應(yīng)與氧化性DNA損傷
        3.5.2 抗氧化劑對ROS生成和細(xì)胞存活率的作用
        3.5.3 抗氧化劑對細(xì)胞凋亡的作用
    3.6 小結(jié)
第四章 喹烯酮致HepG2細(xì)胞全基因組表達(dá)譜的改變
    4.1 引言
    4.2 材料
        4.2.1 藥物
        4.2.2 細(xì)胞株
        4.2.3 試劑盒
        4.2.4 表達(dá)譜基因芯片
        4.2.5 主要試劑
        4.2.6 主要儀器
    4.3 方法
        4.3.1 溶液配制
        4.3.2 細(xì)胞染毒
        4.3.3 芯片檢測樣品的制備
        4.3.4 表達(dá)譜芯片的檢測
        4.3.5 芯片的數(shù)據(jù)處理與分析
    4.4 結(jié)果與分析
        4.4.1 RNA樣品純度和質(zhì)量鑒定結(jié)果
        4.4.2 芯片掃描圖像結(jié)果
        4.4.3 芯片檢測質(zhì)控結(jié)果
        4.4.4 芯片數(shù)據(jù)的視圖分析結(jié)果
        4.4.5 芯片數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果
        4.4.6 生物信息學(xué)分析結(jié)果
    4.5 討論
        4.5.1 基因芯片檢測技術(shù)
        4.5.2 喹烯酮誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞全基因表達(dá)譜的改變
        4.5.3 細(xì)胞凋亡相關(guān)差異基因的分析
    4.6 小結(jié)
第五章 喹烯酮致細(xì)胞凋亡分子調(diào)節(jié)機(jī)理的研究
    5.1 引言
    5.2 材料
        5.2.1 藥物
        5.2.2 細(xì)胞株
        5.2.3 抗體
        5.2.4 試劑盒
        5.2.5 主要試劑
        5.2.6 主要儀器
    5.3 方法
        5.3.1 溶液配制
        5.3.2 TUNEL實(shí)驗(yàn)
        5.3.3 線粒體膜電位的測定
        5.3.4 胞漿蛋白的提取
        5.3.5 Caspase酶活性檢測
        5.3.6 Annexin V-FITC/PI雙染法定量檢測細(xì)胞凋亡
        5.3.7 Real-time qPCR檢測凋亡相關(guān)基因
        5.3.8 Western Blot檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)
        5.3.9 數(shù)據(jù)分析
    5.4 結(jié)果與分析
        5.4.1 TUNEL法流式檢測結(jié)果
        5.4.2 線粒體膜電位的變化
        5.4.3 細(xì)胞色素C的釋放
        5.4.4 Caspase酶活性的變化
        5.4.5 Caspase抑制劑對細(xì)胞凋亡的影響
        5.4.6 TNFR1和TNF-α蛋白表達(dá)的變化
        5.4.7 TNFR1受體阻斷劑對凋亡的影響
        5.4.8 凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)的變化
        5.4.9 凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的變化
    5.5 討論
        5.5.1 喹烯酮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的DNA變化
        5.5.2 喹烯酮誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的分子信號通路
        5.5.3 p38 MAPK和JNK信號對喹烯酮所致凋亡的調(diào)節(jié)作用
    5.6 小結(jié)
第六章 結(jié)論及研究展望
    6.1 結(jié)論
    6.2 研究展望
第七章 創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
致謝
個人簡介



本文編號：3382013