發(fā)布時間：2021-09-02 02:01

　　偽狂犬病（PR）是一種對豬等哺乳動物具有重大經(jīng)濟影響的病毒性疾病,一旦爆發(fā),將會對全世界養(yǎng)豬行業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。目前,接種偽狂犬病疫苗是絕大多數(shù)發(fā)展中國家控制和預防PR最有效的方式之一。由于偽狂犬病病毒（PRV）具有泛嗜性,對多種哺乳動物細胞敏感,常將PRV接種BHK-21細胞、PK-15細胞及Vero細胞等進行擴增并生產(chǎn)PR滅活病毒疫苗。隨著新型PRV變異株的出現(xiàn)導致中國豬群中PRV感染情況惡化以及畜牧業(yè)的飛速發(fā)展,PR滅活病毒疫苗的需求量劇增。而現(xiàn)階段我國PR滅活病毒疫苗的生產(chǎn)工藝主要存在工藝不穩(wěn)定及企業(yè)生產(chǎn)效率低下等問題,相對落后的滾瓶工藝以及反應器微載體懸浮工藝生產(chǎn)PR滅活病毒疫苗是導致目前企業(yè)生產(chǎn)效率低下的主要原因。因此,采用生物反應器無血清懸浮培養(yǎng)哺乳動物細胞高效擴增PRV是解決當前問題的關鍵。所以,建立穩(wěn)定可行的無血清懸浮培養(yǎng)動物細胞高效擴增PRV的生產(chǎn)工藝,對于減輕PR在中國養(yǎng)豬行業(yè)造成的經(jīng)濟損失是非常有必要的。本文首先以自主開發(fā)的培養(yǎng)基以及自主懸浮馴化的對PRV較為敏感的BHK-21細胞、PK-15細胞及Vero細胞為研究對象,考察以上三種備選細胞在各自生長培養(yǎng)基... 

【文章來源】：華東理工大學上海市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：67 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１．２偽狂犬病病毒的感染途徑示意圖??

為０．００５，接??毒時密度為３．０（＾１〇６（＾１１８／１１１１，搖瓶裝液量為３〇１１１１，對以上三種備選細胞分別進行相同??操作條件下的ＰＲＶ接毒實驗。分別在：ＰＲＶ感染后第２４?ｈ、４８?ｈ及７２?ｈ進行取樣計數(shù)、??檢測細胞活率，并留�。玻埃�?ｐｉ無菌樣用于后續(xù)的ＰＲＶ滴度的測定。??３．３結果與討論??３．３．１種毒適應??將ＰＲＶ病毒株首先在ＳＴ貼壁細胞中適應１代得到Ｐ０代種毒，之后在無血清懸浮??細胞ＢＨＫ－２１中進行傳代適應得到Ｐ１－Ｐ４代種毒，ＰＲＶ傳代適應結果如圖３．１所示。??１〇?１??１０?ｔ???二９?＿?Ａ?□?Ｐ０?０Ｐ２?°Ｐ３?０Ｐ４?ｆ?９＿?Ｂ?ＱＰ〇?Ｅ３Ｐ１?ＢＰ２?０Ｐ３?ＳＰ４??ｉ：：?ｊ?ｊｉ?ｉｉ?ｉ＼：：?＿?ｉ?“??Ｈ１纖ｆｅ＿．＿?ｉｘ：ｌｉ?１?１?１?Ｍ??２４?Ｔｉｍｅ?ｐｏｓｔ?ｉｎａｃｔｉｏｎ?（ｈｏｕｒ）７２?Ｐ〇?Ｐ１?Ｐ２?Ｐ３?Ｐ４??圖３．１傳代適應過程中病毒滴度（Ａ）和每代種毒最大病毒滴度（Ｂ）??Ｆｉｇ．?３．１?Ｖｉｒｕｓ?ｔｉｔｅｒ?（Ａ）?ａｎｄ?ｍａｘｉｍｕｍ?ｖｉｒｕｓ?ｔｉｔｅｒ?ｆｏｒ?ｅａｃｈ?ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ?（Ｂ）?ｉｎ?ｐａｓｓ－ｔｈｒｏｕｇｈ?ｃｕｌｔｕｒｅ??由圖３．１可見，在連續(xù)的ＰＲＶ傳代適應過程中，Ｐ０代種毒在接毒后第７２?ｈ達到最??大ＰＲＶ滴度，為８．００１ｇＴＣＩＤ５Ｑ／ｍｌ?（Ｐ０）。Ｐ１－Ｐ４代種毒是在懸浮細胞ＢＨＫ－２１中進行傳??代適應后所得，不斷傳代適應過程中的Ｐ１－Ｐ４代種毒的ＰＲＶ滴度呈現(xiàn)出先上升后下降??的趨勢，都在ＰＲＶ感染后第４８ｈ達到最大ＰＲＶ滴度。Ｐ１－Ｐ４代

性維持的基矗細胞是否適應培養(yǎng)基，是否在培養(yǎng)基中能夠正常增殖，對??整個偽狂犬病病毒生產(chǎn)工藝起著至關重要的作用。為此需要考察ＢＨＫ－２１細胞、ＰＫ－１５??細胞及Ｖｅｒｏ細胞在其相對應的培養(yǎng)基中的形態(tài)，長期連續(xù)穩(wěn)定的傳代和批培養(yǎng)生長情??況等。??３．３．２．１細胞形態(tài)??分別取傳代培養(yǎng)過程中的ＢＨＫ－２１細胞、ＰＫ－１５細胞及Ｖｅｒｏ細胞進行計數(shù)，觀察三??種細胞的形態(tài)、直徑與細胞活率。??義??１。謂、ｖ?Ｖ，Ｖ。。Ｋ??ＢＨＫ－２１細胞?ＰＫ－１５細胞?Ｖｅｒｏ細胞??圖３．２?ＢＨＫ－２１細胞、ＰＫ－丨５細胞及Ｖｅｒｏ細胞的生長形態(tài)??Ｆｉｇ．?３．２?Ｃｅｌｌ?ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ?ｏｆ?ＢＨＫ－２１?ｃｅｌｌｓ，?ＰＫ－１５?ｃｅｌｌｓ?ａｎｄ?Ｖｅｒｏ?ｃｅｌｌｓ??由圖３．２可見，ＢＨＫ－２１細胞、ＰＫ－１５細胞及Ｖｅｒｏ細胞在各自的無血清培養(yǎng)基中的??細胞狀態(tài)良好，未見明顯結團的現(xiàn)象、細胞形態(tài)圓潤、亮而通透、大小均一且輪廓清晰。??ＢＨＫ－２１細胞、ＰＫ－１５細胞及Ｖｅｒｏ細胞的平均直徑分別為１５．５０叫１、１７．５０?ｕｒｎ、１５．８０叫，??三種細胞活率都在９９％以上，表明以上三種備選細胞在各自的培養(yǎng)基中都能很好的適??應。??３．３．２．２傳代情況??將己經(jīng)連續(xù)穩(wěn)定傳代了?３次以上的種子細胞稀釋接種到該細胞所對應的無血清培養(yǎng)??基中，密度為１．００＞＜１０６￡６１１３／１１１１，培養(yǎng)體系為１２５〇１丨的小搖瓶，裝液量為３０?１１１丨并放置??于轉速為１３０ｒｐｍ的搖床上，恒溫培養(yǎng)箱的參數(shù)設定為３７°Ｃ、５％Ｃ〇２。每間隔２４ｈ取??


本文編號：3378086