作為基因轉(zhuǎn)移的載體,腺聯(lián)病毒（adeno-associated virus, AAV）具有外源基因表達(dá)穩(wěn)定、感染細(xì)胞類型多、無致病性、免疫原性低等優(yōu)點,重組AAV載體在基因治療研究中受到越來越多的重視。目前對于AAV基因組復(fù)制的研究較為詳細(xì),但病毒裝配的研究很少。AAV基因組由分別編碼非結(jié)構(gòu)蛋白Rep和結(jié)構(gòu)蛋白Cap的開放閱讀框（ORF）組成,其中Cap基因有兩個ORF, ORF1編碼衣殼蛋白、VP1、VP2和VP3,VP3為病毒衣殼的主要成分,也是決定AAV血清型的主要蛋白質(zhì)；ORF2編碼病毒裝配活性蛋白（AAP）。本研究主要為進(jìn)一步研究AAV各亞型和VP3蛋白之間的關(guān)系提供有效的生物工具。本研究以含有5型AAV Cap基因的質(zhì)粒（pAAV5-2）為模板,PCR擴(kuò)增5型腺聯(lián)病毒AAP編碼序列（AAP5）；以pCRAAAV為模板,PCR擴(kuò)增禽腺聯(lián)病毒VP3編碼序列（AVP3）,將擴(kuò)增的目的片段分別插入原核表達(dá)載體pET-30a,進(jìn)行原核表達(dá)。SDS-PAGE分析結(jié)果表明表達(dá)的AAP5蛋白為預(yù)期的44KD,主要存在于重組菌裂解物離心后的上清中；AVP3蛋白為預(yù)期的81KD,主要以包涵體形... 

【文章來源】：揚(yáng)州大學(xué)江蘇省

【文章頁數(shù)】：54 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
目錄
縮寫中英文對照
綜述 腺聯(lián)病毒的研究進(jìn)展
    1 腺聯(lián)病毒的生物學(xué)特性
        1.1 理化特性
        1.2 基因組結(jié)構(gòu)
        1.3 腺聯(lián)病毒的復(fù)制周期
        1.4 腺聯(lián)病毒的衣殼裝配
        1.5 AAP蛋白和VP3蛋白的關(guān)系
    2 禽腺聯(lián)病毒
    3 重組載體的應(yīng)用
    參考文獻(xiàn)
研究內(nèi)容一
    1 材料
        1.1 載體、菌株、質(zhì)粒
        1.2 主要生物學(xué)試劑
        1.3 主要儀器設(shè)備
        1.4 培養(yǎng)液
        1.5 感受態(tài)的制備
        1.6 純化蛋白的試劑的配制
    2 試驗方法和步驟
        2.1 原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
        2.3 蛋白的純化
    3 結(jié)果與分析
        3.1 表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建
        3.2 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化
    4 討論
研究內(nèi)容二
    1 材料
        1.1 細(xì)胞和實驗動物
        1.2 主要生物學(xué)試劑
        1.3 主要儀器設(shè)備
        1.4 細(xì)胞培養(yǎng)基的配制
    2 方法
        2.1 小鼠免疫
        2.2 真核表達(dá)載體構(gòu)建
        2.3 細(xì)胞的準(zhǔn)備
        2.4 轉(zhuǎn)染
        2.5 間接免疫熒光
        2.7 方陣試驗確定最佳包被抗原濃度及陽性血清效價的測定
        2.8 細(xì)胞融合
        2.9 陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選
        2.10 亞克隆
        2.11 單克隆抗體的Westem-blot特異性檢測
        2.12 腹水制備
        2.13 單克隆抗體ELISA效價測定
    3 結(jié)果
        3.1 小鼠免疫血清的抗體效價檢測
        3.2 腹水單克隆抗體的效價測定
        3.3 腹水單克隆抗體的特異性測定
        3.4 免疫血清的特異性檢測
    4 討論
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]禽腺聯(lián)病毒的分離及其基因組鑒定[J]. 王建業(yè),孫懷昌,朱國強(qiáng).  揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報. 2005(02)



本文編號：3375626