口蹄疫（foot-and-mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus,FMDV）感染引起的偶蹄動(dòng)物共患的一種高度接觸性傳染病,能夠造成重大的經(jīng)濟(jì)損失和不良的政治影響。本研究以FMDV A型AF/72毒株為材料,利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng),構(gòu)筑FMDV A型的病毒樣顆粒（virus-like particles,VLPs）,為FMD疫苗研究提供新策略。1、本研究完成了FMDV A型AF/72株衣殼蛋白P12A與蛋白酶3C基因的克隆,并將其連接到p MD19-T載體上進(jìn)行測(cè)序。對(duì)衣殼蛋白P12A與蛋白酶3C基因進(jìn)行序列分析,發(fā)現(xiàn)FMDV A型AF/72株的P1結(jié)構(gòu)編碼區(qū)全長(zhǎng)為2211bp,編碼737aa。編碼的4種結(jié)構(gòu)蛋白分別為VP4 255bp（85aa）、VP2 654bp（218aa）、VP3 663bp（221aa）和VP1 639bp（213aa）。2A基因全長(zhǎng)48bp,編碼16aa。3C基因全長(zhǎng)639bp,編碼213aa。2、本研究采用兩種不同的策略來研究FMDV A型AF/72株VLPs的組裝。一是通過限制性酶切... 

【文章來源】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：59 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略表
第一章 緒論
    1.1 口蹄疫病毒
    1.2 口蹄疫疫苗研究進(jìn)展
        1.2.1 弱毒疫苗
        1.2.2 滅活疫苗
        1.2.3 蛋白質(zhì)疫苗與合成肽疫苗
        1.2.4 DNA疫苗
    1.3 FMDV VLPs的研究進(jìn)展
        1.3.1 天然FMDV衣殼蛋白的組裝
        1.3.2 嵌合VLPs在抗口蹄疫中的研究
        1.3.3 FMDV自身VLPs在抗口蹄疫中的研究
        1.3.4 影響FMDV VLPs產(chǎn)生的因素
    1.4 總結(jié)與展望
第二章 FMDV AF72株衣殼蛋白P12A與蛋白酶 3C基因的克隆與分析
    2.1 材料
        2.1.1 主要試劑
        2.1.2 主要儀器
    2.2 試驗(yàn)方法
        2.2.1 FMDV AF/72株RNA的提取
        2.2.2 初始引物的合成與克隆
        2.2.3 特異性引物的設(shè)計(jì)合成與特異性目的基因的克隆
    2.3 試驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 P12A和 3C長(zhǎng)片段基因的RT-PCR
        2.3.2 P12A和 3C長(zhǎng)片段基因的克隆與鑒定
        2.3.3 特異性P12A與 3C基因的PCR擴(kuò)增
        2.3.4 P12A和 3C特異性片段的克隆及鑒定
    2.4 P12A和 3C基因序列分析
    2.5 討論與小結(jié)
第三章 FMDV AF/72株VLPS的表達(dá)與組裝研究
    3.1 試驗(yàn)材料
        3.1.1 材料
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 主要儀器
    3.2 試驗(yàn)方法
        3.2.1 重組轉(zhuǎn)移載體PFASTBAC? HTB-P12A3C的構(gòu)建
        3.2.2 重組轉(zhuǎn)移載體PFASTBAC? DUAL-P12A3C的構(gòu)建
        3.2.3 E.COLI DH10 BAC感受態(tài)細(xì)胞的制備
        3.2.4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli DH10 Bac感受態(tài)細(xì)胞
        3.2.5 重組桿狀病毒質(zhì)粒的提取
        3.2.6 重組桿狀病毒質(zhì)粒的PCR鑒定
        3.2.7 Sf9細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)
        3.2.8 重組桿狀病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞
        3.2.9 P1代毒株的擴(kuò)增
        3.2.10 P3代毒株的PCR鑒定
        3.2.11 重組蛋白的間接免疫熒光檢測(cè)
        3.2.12 重組蛋白的Western-blot檢測(cè)
        3.2.13 蔗糖密度梯度離心純化
        3.2.14 電鏡觀察
    3.3 試驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 P12A基因的雙酶切
        3.3.2 重組桿粒pFastBac? HTB-P12A與pFastBac? Dual-P12A的構(gòu)建及鑒定
        3.3.3 3C 基因的雙酶切
        3.3.4 重組桿粒pFastBac? HTB-P12A3C與pFastBac? Dual-P12A3C的構(gòu)建及鑒定
        3.3.5 重組桿粒Bacmid-HTB-P12A3C與Bacmid-Dual-P12A3C的構(gòu)建與鑒定
        3.3.6 重組桿粒轉(zhuǎn)染 Sf9 細(xì)胞及 PCR 鑒定
        3.3.7 間接免疫熒光分析
        3.3.8 Western-blot檢測(cè)
        3.3.9 目的蛋白的電鏡觀察
    3.4 討論與小結(jié)
第四章 FMDV AF/72株VLPs或中間體的免疫原性分析
    4.1 試驗(yàn)材料
        4.1.1 材料
        4.1.2 主要試劑
    4.2 試驗(yàn)方法
        4.2.1 疫苗的制備
        4.2.2 動(dòng)物免疫
        4.2.3 豚鼠采血
        4.2.4 抗FMDV特異性抗體的檢測(cè)
        4.2.5 微量中和抗體檢測(cè)
        4.2.6 細(xì)胞因子的檢測(cè)
        4.2.7 動(dòng)物保護(hù)試驗(yàn)
    4.3 試驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 抗口蹄疫病毒特異性血清抗體水平
        4.3.2 微量中和抗體的檢測(cè)
        4.3.3 細(xì)胞因子的檢測(cè)
        4.3.4 動(dòng)物保護(hù)試驗(yàn)
    4.4 討論與小結(jié)
第五章 全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
作者簡(jiǎn)歷


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]利用SUMO表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)豬O型口蹄疫病毒VP0、VP1、VP3基因[J]. 宋妮,溫永俊,王鳳雪,武華.  中國(guó)畜牧獸醫(yī). 2013(09)
[2]登革病毒3型病毒樣顆粒在酵母體內(nèi)的表達(dá)與鑒定[J]. 付春云,方丹云,劉巖,喻治準(zhǔn),江漢寧,江麗芳,周俊梅.  熱帶醫(yī)學(xué)雜志. 2011(06)
[3]人乳頭瘤病毒18型病毒樣顆粒在大腸桿菌中的表達(dá)及免疫原性分析[J]. 謝明輝,李少偉,沈文通,李仲藝,莊玉娣,莫小兵,顧穎,吳婷,張軍,夏寧邵.  生物工程學(xué)報(bào). 2009(07)
[4]昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)的研究及應(yīng)用[J]. 劉永平,王方海,蘇志堅(jiān),李廣宏,龐義.  昆蟲知識(shí). 2006(01)
[5]轉(zhuǎn)基因枸杞表達(dá)HIV-1殼體蛋白病毒樣顆粒疫苗表達(dá)載體的構(gòu)建[J]. 孫曉光,宋長(zhǎng)征,張更林.  中國(guó)生物工程雜志. 2005(08)
[6]原核表達(dá)的兔出血癥病毒衣殼蛋白對(duì)兔的免疫保護(hù)效果[J]. 王永山,陸承平,周宗安,薛家賓.  中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué). 2004(11)
[7]按酵母基因優(yōu)化的HPV6型L1蛋白在大腸桿菌中高效表達(dá)[J]. 李平川,張曉光,周玲,曾毅.  病毒學(xué)報(bào). 2004(03)
[8]共表達(dá)口蹄疫病毒衣殼蛋白前體P1-2A基因和蛋白酶3C基因重組雞痘病毒的構(gòu)建及其免疫原性[J]. 金寧一,張洪勇,尹革芬,鄭敏,劉彤,江文正,李子健.  科學(xué)通報(bào). 2004(06)
[9]酵母表達(dá)系統(tǒng)及其應(yīng)用研究[J]. 吳麗娟,蔣建新,朱佩芳,王正國(guó),康格非.  生命的化學(xué). 2003(01)
[10]豬細(xì)小病毒VP2蛋白在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)及其特性[J]. 呂建強(qiáng),陳煥春,趙俊龍,肖少波,王革非.  微生物學(xué)報(bào). 2002(06)

碩士論文
[1]牛IL-2和IFN-γ對(duì)Asia1型口蹄疫病毒G-H環(huán)多肽免疫效果的影響[D]. 葛蘭云.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2009



本文編號(hào)：3375476