無菌采集重慶市某奶牛場(chǎng)乳房炎患牛奶樣,利用MYP選擇培養(yǎng)基無菌分離培養(yǎng)得到1株疑似蠟樣芽孢桿菌的純培養(yǎng)物,利用全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)、16S rRNA、KB法藥敏試驗(yàn)、MLST分型和PCR擴(kuò)增hblA、hblC、hblD、nheA、nheB、nheC、cytK、entFM、Ces毒力基因及測(cè)序,并通過測(cè)定小鼠LD₅₀,血清ALT、AST、LDH和ALP活性,肝臟組織SOD、MDA、GSH-Px水平及病變組織病理組織學(xué)觀察進(jìn)行分析鑒定。結(jié)果顯示,分離株在甘露醇卵黃多黏菌素瓊脂（MYP）平板上,形成周圍有白色至淡粉紅色的菌落,在蠟樣芽孢桿菌顯色培養(yǎng)基上形成具有白色光暈的藍(lán)色菌落,革蘭染色陽性。全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)鑒定為蠟樣芽孢桿菌,鑒定可信度為99.9%,典型度為132 （典型）。16S rRNA序列與與韓國（FJ982661.1）、美國（NZ_JURK01000037.1）、斯里蘭卡（MG827268.1）、馬來西亞（MN093796.1）株同源性為100%,同美國奶源分離株（NZ_ASPZ01000016.1）親緣關(guān)系最近。藥... 

【文章來源】：中國獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2020,40(08)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

Bc分離株的生長(zhǎng)及染色特性

以分離菌基因組DNA為模板,分別以hblA、hblC、hblD、nheA、nheB、nheC、cytK、entFM、Ces基因引物序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè),結(jié)果hblA、hblC、hblD、nheA、nheB、nheC、cytK、entFM基因擴(kuò)增片段分別為480,750,550,300,730,400,800,1 200 bp,同預(yù)期片段大小一致;沒有擴(kuò)增出Ces基因的目的片段(圖5)。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果表明,nheA基因片段同日本分離的炭疽桿菌(AP019731.1)毒力基因同源性高達(dá)96.91%,entFM基因片段同美國Bc(CP001186.1)同源性為97.45%,nheB基因片段同挪威Bc(CP001283.1)同源性高達(dá)95.48%,其他基因測(cè)序結(jié)果表明均為Bc毒力相關(guān)基因(表4)。表2 分離菌株的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果 mm 抗菌藥物 抑菌圈直徑敏感性標(biāo)準(zhǔn) 抑菌圈直徑 敏感性 耐藥(R) 中敏(I) 敏感(S) 復(fù)方新諾明 ≤10 11～15 ≥16 21 S 大觀霉素 ≤14 15～17 ≥18 13 R 諾氟沙星 ≤12 13～16 ≥17 19 S 呋喃妥因 ≤14 15～16 ≥17 16 I 苯唑西林 ≤10 11～12 ≥13 30 S 米諾環(huán)素 ≤14 13～18 ≥19 27 S 萬古霉素 ≤14 - ≥15 14 R 四環(huán)素 ≤14 15～18 ≥19 23 S 環(huán)丙沙星 ≤15 16～20 ≥21 26 S 青霉素G ≤28 - ≥29 42 S 克林霉素 ≤14 15～20 ≥21 26 S 多粘菌素B ≤8 9～11 ≥12 0 R 紅霉素 ≤13 14～22 ≥23 25 S 克拉霉素 ≤13 14～17 ≥18 25 S 氯霉素 ≤12 13～17 ≥18 18 S 左氟沙星 ≤13 14～16 ≥17 23 S

攻毒后小鼠均出現(xiàn)不同程度的腹瀉、采食量下降、被毛松亂、精神沉郁、嗜睡等癥狀。攻毒后5 d最高劑量組(4×1011 CFU/mL)小鼠開始出現(xiàn)死亡,攻毒后10 d最高劑量組小鼠全部死亡。次劑量組(4×1010 CFU/mL和4×109CFU/mL),分別死亡8只和6只,死亡時(shí)間主要集中在攻毒后11～13 d。最低劑量組(4×108 CFU/mL)未出現(xiàn)死亡,對(duì)照組小鼠未發(fā)病和死亡。采用Reed-Muench法計(jì)算該分離菌LD50為 1.44×1010 CFU。剖檢發(fā)病死亡小鼠,發(fā)現(xiàn)肝表面顏色變淡,腫大、質(zhì)脆,呈黃白色,劑量越大,顏色越淡,有的出現(xiàn)明顯散在壞死灶;脾臟腫大,充血;肺臟有出血壞死;心肌變性壞死;腸道黏膜脫落,腸道內(nèi)充滿黃褐色水樣液體等病變特征;同劑量組死亡小鼠中,經(jīng)腹腔注射攻毒小鼠病變更加明顯。無菌條件下采集病死小鼠肝臟、腸內(nèi)容物及肺臟中均分離出目的細(xì)菌,經(jīng)菌落PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物測(cè)序,比對(duì)為目的菌。與正常對(duì)照組比較,不同劑量Bc攻毒組小鼠血清ALT、AST、LDH及ALP含量均明顯升高,差異顯著 (P<0.05 )。與正常對(duì)照組比較,不同劑量Bc攻毒組小鼠肝臟組織SOD、GSH-PX含量明顯降低,MDA含量顯著升高,差異顯著(P<0.05)(表5)。對(duì)次劑量組(4×1010 CFU/mL)小鼠剖檢,取肝臟經(jīng)HE染色觀察正常組小鼠肝中央靜脈、肝血竇結(jié)構(gòu)清晰,肝細(xì)胞無壞死、變性。攻毒組肝細(xì)胞腫大、肝索排列紊亂,肝細(xì)胞空泡變性,肝血竇變窄;腸黏膜脫落,變性壞死;腎間質(zhì)淤血,腎小管上皮細(xì)胞脫落,近曲小管上皮細(xì)胞壞死、脫落及出現(xiàn)蛋白管型,腎小囊腔增寬、出血等(圖6)。表3 Pubmlst數(shù)據(jù)庫Bc 20株ST型 ST glpF gmK ilvD pta pur pycA tpi 克隆復(fù)合物 476 127 27 134 126 131 42 100 1341 127 27 276 126 131 42 100 1813 127 27 209 126 131 42 100 2327 127 27 276 184 131 169 100 2350 127 27 134 184 131 42 100 74 42 27 37 41 40 42 32 764 178 27 209 184 131 169 100 825 178 27 209 184 131 42 100 1815 178 27 209 14 9 169 7 1832 178 27 209 126 131 42 100 2214 183 27 276 184 244 42 88 1342 229 5 271 126 16 183 190 1230 13 8 8 11 131 12 10 ST-142 complex 1231 40 9 14 12 131 25 7 ST-18 complex 2033 15 7 7 2 131 8 13 ST-23 complex 950 221 131 247 227 211 42 177 771 197 117 225 204 191 172 100 1759 197 117 316 204 191 6 100 1826 197 117 316 204 191 172 100 2090 197 117 373 204 191 172 100

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]我國部分地區(qū)奶牛乳房炎主要病原菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J]. 杜琳,王麗芳,馮小慧,張三粉,宋潔,姚一萍,史培,申捷.  動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2018(03)
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碩士論文
[1]嬰幼兒食品中嘔吐型蠟樣芽孢桿菌的鑒別與多位點(diǎn)序列分析[D]. 張翼.武漢輕工大學(xué) 2015



本文編號(hào)：3370546