發(fā)布時(shí)間：2021-08-29 04:58

　　試驗(yàn)旨在對(duì)水牛pri-miR-16b基因進(jìn)行克隆并構(gòu)建腺病毒表達(dá)載體,且對(duì)水牛miR-16b及其預(yù)測(cè)靶基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析,為研究其在水牛卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中的作用奠定基礎(chǔ)。利用RT-PCR技術(shù)從水牛卵巢基因組中擴(kuò)增pri-miR-16b基因,采用同源重組的方法構(gòu)建pDC316-mCMV-EGFP-pri-miR-16b質(zhì)粒;利用BLAST程序進(jìn)行同源性分析,Mega 7.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),ViennaRNA Web Services預(yù)測(cè)pre-miR-16b的二級(jí)結(jié)構(gòu)。對(duì)腺病毒質(zhì)粒與腺病毒骨架質(zhì)粒pBHGloxdelE13cre進(jìn)行包裝,經(jīng)過(guò)3次擴(kuò)增獲得含有pri-miR-16b的腺病毒顆粒,將獲得的病毒顆粒命名為Ad-miR-16b,并進(jìn)行病毒滴度測(cè)定;利用Ad-miR-16b感染水牛卵丘細(xì)胞,實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-16b在卵丘細(xì)胞中的表達(dá)情況。利用TargetScan對(duì)miR-16b進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè),對(duì)預(yù)測(cè)的靶基因進(jìn)行KEGG通路富集。結(jié)果顯示,試驗(yàn)成功克隆水牛pri-miR-16b序列,通過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)與牛的序列相似性分別為100%,與其他物種同源性較高,和黃牛的親緣關(guān)系最近... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)畜牧獸醫(yī). 2020,47(08)北大核心

【文章頁(yè)數(shù)】：10 頁(yè)

【部分圖文】：

pDC316-mCMV-EGFP-pri-miR-16b腺病毒質(zhì)粒

試驗(yàn)成功擴(kuò)增出493 bp的pri-miR-16b序列,膠回收目的片段;pDC316-mCMV-EGFP質(zhì)粒經(jīng)Hind Ⅲ酶切處理,膠回收線性化質(zhì)粒,用重組酶連接,酶切鑒定正確后(圖2),送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與牛pri-miR-16b序列基本一致。2.2 pre-miR-16b序列分析

將測(cè)序得到的水牛pre-miR-16b序列通過(guò)RNAfold獲得pre-miR-16b的二級(jí)結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)其帶有典型的單一莖環(huán)結(jié)構(gòu),且成熟序列位于莖環(huán)結(jié)構(gòu)的5′臂上(圖3)。通過(guò)NCBI BLAST將水牛pre-miR-16b與黃牛(登錄號(hào):NR_030891.1)、山羊(登錄號(hào):NR_129608.1)、家兔(登錄號(hào):NR_162460.1)、鴨嘴獸(登錄號(hào):NR_034777.1)、斑胸草雀(登錄號(hào):NR_049124.1)、非洲爪蟾(登錄號(hào):NR_049654.1)、蜥蜴(登錄號(hào):NR_129879.1)和灰短尾鼠(登錄號(hào):NR_127564.1)進(jìn)行相似性分析。結(jié)果顯示,相似性分別為100%、97.8%、92.1%、89.8%、80.8%、76.5%、87.9%和85.7%(圖4)。利用Mega 7.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知,水牛和黃牛同屬�？�,聚為一支,親緣關(guān)系最近。圖4 水牛與其他物種pre-miR-16b基因同源性比對(duì)

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]腺病毒載體構(gòu)建研究進(jìn)展[J]. 劉玉玲,鐘柏茂.  國(guó)際兒科學(xué)雜志. 2018 (03)
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本文編號(hào)：3369957