羊毛是全球經(jīng)濟(jì)中重要的農(nóng)產(chǎn)品。在綿羊育種中羊毛長度是最有價(jià)值的性狀之一。研究發(fā)現(xiàn)FGF5（Fibroblast Growth Factor 5）是毛囊周期性生長的抑制因子,當(dāng)小鼠的FGF5基因缺失時(shí)其被毛長度顯著增加。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因是FGF5基因的沉默可以延長毛發(fā)生長周期中的生長期,進(jìn)而產(chǎn)生毛發(fā)長度增加的表型。近幾年,CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat/CRISPR Associated 9）作為一種新型的基因組編輯技術(shù)被廣為應(yīng)用,它在原核胚時(shí)期即可對(duì)動(dòng)物模型和家畜進(jìn)行有效的遺傳編輯。本研究通過原核注射Cas9 mRNA和sgRNA（Single Guide RNA）的方法,成功利用CRISPR/Cas9技術(shù)生產(chǎn)出FGF5基因敲除綿羊。本研究首先根據(jù)綿羊的密碼子偏嗜性對(duì)釀膿鏈球菌SF370的Cas9基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化,提高其在綿羊體內(nèi)的表達(dá)效率。在綿羊基因組中共篩選設(shè)計(jì)了 3個(gè)靶向FGF5基因的sgRNAs。將優(yōu)化后的綿羊Cas9及sgRNAs序列亞克隆構(gòu)建真核表達(dá)載體U6-C... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)北京市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：79 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

993年一0”年中國原毛進(jìn)出口貿(mào)易皿(FAO

１丄２巧指核酸酶??巧指核酸酶（ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ?ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，ＺＦＮ）是一種人工改造的核酸內(nèi)切酶，它由持異性的ＤＮＡ??結(jié)合結(jié)構(gòu)域和非特異性的切割域兩部分構(gòu)成，是一個(gè)異源二聚體，其結(jié)構(gòu)如圖１－２所示。??ＤＮＡ結(jié)合結(jié)構(gòu)域是由兩個(gè)半化氨酸、兩個(gè)組氨酸和一個(gè)巧離子共輛形成的單巧指模塊Ｉ每個(gè)巧??指模塊識(shí)別３－４個(gè)堿基的序列，將運(yùn)些模塊混搭，就能夠靴向到我們期望的位置早期研究??中多采用左右兩邊各３個(gè)碎指蛋白識(shí)別總共１８ｂｐ的序列，也有構(gòu)建方法通泣增加巧指蛋白數(shù)目??到左右兩邊各６個(gè)，從而增強(qiáng)識(shí)別的特異性１＂１。巧指核酸酶的切割域主要是指核酸內(nèi)切酶機(jī)Ｗ，??單個(gè)仍Ｗ不能產(chǎn)生切割活性ｉｎ’?Ｗ。只有當(dāng)兩個(gè)識(shí)別位點(diǎn)的間距為６－８?ｂｐ時(shí)，兩個(gè)仍別單體才??能相互作用形成二聚體行使酶切功能，從而實(shí)現(xiàn)基因修飾的目的ＰＷ。??到目前為止，ＺＦＮ已經(jīng)成功應(yīng)用于果蛹口１，線蟲ｔｎｉ，斑馬魚口１，大鼠ｔＭＩ、擬南芥Ｐ５’２６１，??煙草Ｐ７’２８１，大豆ｐｓｉ，玉米ＰＷ等模式動(dòng)植物：同時(shí)也應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞模型Ｐ１１和小鼠的血友病??模型ｉｎｉ；還應(yīng)用于家蠶ＰＳＩ、豬牛Ｐ９呼日兔子等經(jīng)濟(jì)動(dòng)物。??巧指核酸酶技術(shù)使得基因組編輯效率得到大大提高

１丄２巧指核酸酶??巧指核酸酶（ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ?ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，ＺＦＮ）是一種人工改造的核酸內(nèi)切酶，它由持異性的ＤＮＡ??結(jié)合結(jié)構(gòu)域和非特異性的切割域兩部分構(gòu)成，是一個(gè)異源二聚體，其結(jié)構(gòu)如圖１－２所示。??ＤＮＡ結(jié)合結(jié)構(gòu)域是由兩個(gè)半化氨酸、兩個(gè)組氨酸和一個(gè)巧離子共輛形成的單巧指模塊Ｉ每個(gè)巧??指模塊識(shí)別３－４個(gè)堿基的序列，將運(yùn)些模塊混搭，就能夠靴向到我們期望的位置早期研究??中多采用左右兩邊各３個(gè)碎指蛋白識(shí)別總共１８ｂｐ的序列，也有構(gòu)建方法通泣增加巧指蛋白數(shù)目??到左右兩邊各６個(gè)，從而增強(qiáng)識(shí)別的特異性１＂１。巧指核酸酶的切割域主要是指核酸內(nèi)切酶機(jī)Ｗ，??單個(gè)仍Ｗ不能產(chǎn)生切割活性ｉｎ’?Ｗ。只有當(dāng)兩個(gè)識(shí)別位點(diǎn)的間距為６－８?ｂｐ時(shí)，兩個(gè)仍別單體才??能相互作用形成二聚體行使酶切功能，從而實(shí)現(xiàn)基因修飾的目的ＰＷ。??到目前為止，ＺＦＮ已經(jīng)成功應(yīng)用于果蛹口１，線蟲ｔｎｉ，斑馬魚口１，大鼠ｔＭＩ、擬南芥Ｐ５’２６１，??煙草Ｐ７’２８１，大豆ｐｓｉ，玉米ＰＷ等模式動(dòng)植物：同時(shí)也應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞模型Ｐ１１和小鼠的血友病??模型ｉｎｉ；還應(yīng)用于家蠶ＰＳＩ、豬牛Ｐ９呼日兔子等經(jīng)濟(jì)動(dòng)物。??巧指核酸酶技術(shù)使得基因組編輯效率得到大大提高

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Generation of a monkey with MECP2 mutations by TALEN-based gene targeting[J]. Zhen Liu,Xue Zhou,Ying Zhu,Zhi-Fang Chen,Bin Yu,Yan Wang,Chen-Chen Zhang,Yan-Hong Nie,Xiao Sang,Yi-Jun Cai,Yue-Fang Zhang,Chen Zhang,Wen-Hao Zhou,Qiang Sun,Zilong Qiu.  Neuroscience Bulletin. 2014(03)
[2]Generation of GGTA1 biallelic knockout pigs via zinc-finger nucleases and somatic cell nuclear transfer[J]. BAO Lei,CHEN HaiDe,JONG UiMyong,RIM CholHo,LI WenLing,LIN XiJuan,ZHANG Dan,LUO Qiong,CUI Chun,HUANG HeFeng,ZHANG Yan,XIAO Lei,FU ZhiXin.  Science China（Life Sciences）. 2014(02)



本文編號(hào)：3367489