體外成熟液中添加PAF對(duì)牦牛卵母細(xì)胞發(fā)育能力及基因表達(dá)的影響
發(fā)布時(shí)間：2021-08-24 20:15
旨在探討體外成熟（IVM）液中添加血小板活化因子（PAF）對(duì)牦牛卵母細(xì)胞發(fā)育能力及基因表達(dá)影響。本試驗(yàn)將牦牛1 025個(gè)卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs）分為4組,分別在含不同濃度PAF(0、10-8、10-7和10-6mol·L-1)的IVM液中成熟后,與奶牛精子體外受精（IVF）和體外培養(yǎng)（IVC）,比較分析各組卵母細(xì)胞成熟率、卵裂率和囊胚率以及COCs和胚胎中抗凋亡（BCL-2）、促凋亡（BAX）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）及其受體（EGFR）、轉(zhuǎn)錄因子（OCT-4和NANOG）和c-fos等基因的表達(dá)量差異。結(jié)果表明,IVM液中PAF濃度為10-7mol·L-1組的卵母細(xì)胞成熟率（（92.16±0.19）%）、卵裂率（（77.20±0.85）%）和囊胚率（（46.71±0.68）%）顯著高于其他組（P<0.05）。qPCR結(jié)果顯示,在該組成熟的COCs中BCL-2、EGF、EGFR、c-fos表達(dá)量顯著上調(diào)（P<0.05）,而促凋亡基因BAX...
【文章來(lái)源】：畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2020,51(03)北大核心CSCD
【文章頁(yè)數(shù)】：10 頁(yè)
【部分圖文】：
IVM液中PAF濃度對(duì)COCs中相關(guān)基因表達(dá)的影響
關(guān)于PAF改善早期胚胎質(zhì)量方面的體內(nèi)、體外研究結(jié)果基本一致,但對(duì)卵泡發(fā)育和受精以及早期胚胎發(fā)育能力方面的研究結(jié)果卻不一致[13-17]。Fukuda和Breuel[15]研究發(fā)現(xiàn),在小鼠排卵前4 d連續(xù)注射PAF對(duì)排卵率、受精率和卵裂率沒(méi)有顯著影響,但PAF可以顯著提高擴(kuò)張囊胚率。但是,Sakellariou等[20]研究則證明,在小鼠排卵前適當(dāng)時(shí)間注射適量的PAF可以顯著提高排卵率、受精率和擴(kuò)張囊胚率。本試驗(yàn)比較研究了在IVM液中添加不同濃度PAF對(duì)牦牛卵母細(xì)胞體外成熟率以及用普通牛精子IVF后卵裂率和囊胚率的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)IVM液中PAF濃度為10-7mol·L-1時(shí),牦牛卵母細(xì)胞成熟率、IVF后的卵裂率和囊胚率均顯著高于PAF高濃度組(10-6mol·L-1)和低濃度組(0、10-8mol·L-1)(P<0.05),即IVM液中PAF濃度為10-7mol·L-1是牦牛體外受精的最佳濃度。Kordan和Strze z ˙ ek [35] 試驗(yàn)證明,外源性PAF在1×10-8～1×10-6mol·L-1濃度時(shí),可顯著增加新鮮和冷凍保存豬精子的運(yùn)動(dòng)能力,以1×10-7mol·L-1濃度為最佳,而高濃度的PAF則可破壞精子的原生質(zhì)膜,從而對(duì)精子產(chǎn)生損傷作用。因此,IVM液中高濃度PAF對(duì)牦牛卵母細(xì)胞的成熟和胚胎發(fā)育不利可能也與PAF對(duì)細(xì)胞膜的損傷作用有關(guān)。Sakellariou等[20]研究證明,小鼠注射單位體重的PAF過(guò)高對(duì)卵母細(xì)胞排卵率、卵裂率、桑囊胚率和擴(kuò)張囊胚率都有不良影響,主要原因是在活體動(dòng)物中高濃度的PAF導(dǎo)致LH水平升高,從而導(dǎo)致卵母細(xì)胞黃體化,影響卵母細(xì)胞質(zhì)量、發(fā)育和附植能力。Ryan等[36]發(fā)現(xiàn),在小鼠胚胎培養(yǎng)液中添加1.86 ×10-7或1.86×10-6mol·L-1 PAF時(shí)對(duì)2-細(xì)胞胚胎的囊胚發(fā)育率和體外培養(yǎng)48或72 h擴(kuò)張囊胚率沒(méi)有顯著影響,但是,高濃度的PAF(9.3×10-6和18.6×10-6mol·L-1)對(duì)胚胎發(fā)育起有害作用。Lee等[19]發(fā)現(xiàn),雖然在IVC液中添加PAF不能提高豬IVF胚胎發(fā)育率,但能顯著提高豬體細(xì)胞核移植(SCNT)胚胎的囊胚率。O’Neill[16]發(fā)現(xiàn),在胚胎培養(yǎng)液中添加PAF能顯著提高小鼠的卵裂率和囊胚率。這些研究結(jié)果的不一致可能與胚胎種類(lèi)(體內(nèi)受精、IVF、SCNT)和培養(yǎng)系統(tǒng)(單位體積培養(yǎng)液中胚胎數(shù)量)的差異有關(guān)。在胚胎培養(yǎng)過(guò)程中,胚胎自分泌PAF和IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ、EGF等生長(zhǎng)因子進(jìn)入培養(yǎng)液,促進(jìn)胚胎發(fā)育[13,16],而胚胎培養(yǎng)液中這些生長(zhǎng)因子的濃度與胚胎種類(lèi)和培養(yǎng)液中胚胎濃度有關(guān)[16]。雖然本研究未測(cè)定COCs和胚胎自分泌的PAF濃度,但是單位體積IVM液中COCs的數(shù)量(每1 000 μL 30枚)和IVC液中胚胎數(shù)量(每40 μL 30枚)符合牦牛和普通牛體外受精基本規(guī)程要求[3-9],因此,篩選出的最佳PAF濃度對(duì)牦牛體外受精具有重要指導(dǎo)意義。PAF對(duì)卵泡發(fā)育和胚胎發(fā)育的作用主要通過(guò)卵泡顆粒細(xì)胞和胚胎細(xì)胞上的PAF受體(PAFr)介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)[19,37]。但是目前,PAF與PAFr結(jié)合后對(duì)基因表達(dá)影響的機(jī)制還不清楚,因此,本研究對(duì)IVM液中PAF對(duì)COCs和胚胎中與細(xì)胞凋亡和增殖相關(guān)的一些重要基因表達(dá)調(diào)控進(jìn)行了研究。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中,抗凋亡因子BCL-2和促凋亡因子BAX為細(xì)胞提供信號(hào)通路,細(xì)胞內(nèi)兩種力量的差異決定細(xì)胞凋亡與發(fā)育命運(yùn)[23-25]。本研究發(fā)現(xiàn),IVM液中PAF濃度對(duì)牦牛卵母細(xì)胞IVM過(guò)程中BCL-2和BAX的表達(dá)有一定影響,IVM中PAF濃度為10-6mol·L-1時(shí)促凋亡基因BAX表達(dá)量顯著高于其他組,而10-7mol·L-1組抗凋亡基因BCL-2表達(dá)量最高,顯著高于10-6mol·L-1組(P<0.05, 圖1)。說(shuō)明IVM液中PAF濃度過(guò)高會(huì)促進(jìn)卵母細(xì)胞凋亡,而濃度為10-7mol·L-1抗凋亡作用較強(qiáng),有利于牦牛卵母細(xì)胞成熟。表皮生長(zhǎng)因子(EGF)及其受體(EGFR)、c-fos因子等能促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化[8,16,26,29]。10-7mol·L-1組COCs中這些基因的表達(dá)水平最高,顯著高于10-6mol·L-1組(P<0.05),說(shuō)明適當(dāng)濃度的PAF可以通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化,從而促進(jìn)牦牛卵母細(xì)胞的體外成熟。有研究表明,IVM液中適宜濃度的FSH也是通過(guò)提高牦牛卵母細(xì)胞EGF、EGFR和BCL-2的表達(dá)及降低BAX的表達(dá)來(lái)提高牦牛卵母細(xì)胞的發(fā)育能力[38]。OCT-4和NANOG主要維持胚胎細(xì)胞的多能性[27-28]。與趙天等[39]的研究結(jié)果一致,OCT-4在牦牛COCs和早期胚胎發(fā)育過(guò)程中的各個(gè)時(shí)期均有表達(dá),且不同時(shí)期該基因的表達(dá)量存在差異,說(shuō)明OCT-4可能參與胚胎合子型基因轉(zhuǎn)錄激活的調(diào)控過(guò)程和維持囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)全能性的過(guò)程。
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]犏牛高效生產(chǎn)新模式的建立[J]. 熊顯榮,李鍵,字向東,蘭道亮,何世明,吳錦波,余忠華,王二耀. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2019(05)
[2]FSH對(duì)牦牛卵母細(xì)胞EGF、EGFR表達(dá)及其細(xì)胞凋亡的影響[J]. 何翃閎,潘陽(yáng)陽(yáng),張慧珠,李秦,王萌,崔燕,樊江峰,余四九. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2018(09)
[3]基于高通量測(cè)序的犏牛囊胚玻璃化冷凍損傷機(jī)制研究[J]. 鄭杰,蒲思穎,楊遠(yuǎn)瀟,王琴,楊繞芬,字向東. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2017(10)
[4]Oct 4在牦牛卵母細(xì)胞及早期胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)[J]. 趙天,李谷月,潘陽(yáng)陽(yáng),李月琴,陳平,溫澤星,崔燕,余四九. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2017(03)
[5]體外受精生產(chǎn)犏牛胚胎與移植試驗(yàn)研究[J]. 孫永剛,徐驚濤,才讓東智,馬志杰. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2013(05)
博士論文
[1]豬早期胚胎發(fā)育中體外培養(yǎng)體系優(yōu)化及OCT4、NANOG功能研究[D]. 郭詩(shī)萌.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2019
本文編號(hào)：3360653
【文章來(lái)源】：畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2020,51(03)北大核心CSCD
【文章頁(yè)數(shù)】：10 頁(yè)
【部分圖文】：
IVM液中PAF濃度對(duì)COCs中相關(guān)基因表達(dá)的影響
關(guān)于PAF改善早期胚胎質(zhì)量方面的體內(nèi)、體外研究結(jié)果基本一致,但對(duì)卵泡發(fā)育和受精以及早期胚胎發(fā)育能力方面的研究結(jié)果卻不一致[13-17]。Fukuda和Breuel[15]研究發(fā)現(xiàn),在小鼠排卵前4 d連續(xù)注射PAF對(duì)排卵率、受精率和卵裂率沒(méi)有顯著影響,但PAF可以顯著提高擴(kuò)張囊胚率。但是,Sakellariou等[20]研究則證明,在小鼠排卵前適當(dāng)時(shí)間注射適量的PAF可以顯著提高排卵率、受精率和擴(kuò)張囊胚率。本試驗(yàn)比較研究了在IVM液中添加不同濃度PAF對(duì)牦牛卵母細(xì)胞體外成熟率以及用普通牛精子IVF后卵裂率和囊胚率的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)IVM液中PAF濃度為10-7mol·L-1時(shí),牦牛卵母細(xì)胞成熟率、IVF后的卵裂率和囊胚率均顯著高于PAF高濃度組(10-6mol·L-1)和低濃度組(0、10-8mol·L-1)(P<0.05),即IVM液中PAF濃度為10-7mol·L-1是牦牛體外受精的最佳濃度。Kordan和Strze z ˙ ek [35] 試驗(yàn)證明,外源性PAF在1×10-8～1×10-6mol·L-1濃度時(shí),可顯著增加新鮮和冷凍保存豬精子的運(yùn)動(dòng)能力,以1×10-7mol·L-1濃度為最佳,而高濃度的PAF則可破壞精子的原生質(zhì)膜,從而對(duì)精子產(chǎn)生損傷作用。因此,IVM液中高濃度PAF對(duì)牦牛卵母細(xì)胞的成熟和胚胎發(fā)育不利可能也與PAF對(duì)細(xì)胞膜的損傷作用有關(guān)。Sakellariou等[20]研究證明,小鼠注射單位體重的PAF過(guò)高對(duì)卵母細(xì)胞排卵率、卵裂率、桑囊胚率和擴(kuò)張囊胚率都有不良影響,主要原因是在活體動(dòng)物中高濃度的PAF導(dǎo)致LH水平升高,從而導(dǎo)致卵母細(xì)胞黃體化,影響卵母細(xì)胞質(zhì)量、發(fā)育和附植能力。Ryan等[36]發(fā)現(xiàn),在小鼠胚胎培養(yǎng)液中添加1.86 ×10-7或1.86×10-6mol·L-1 PAF時(shí)對(duì)2-細(xì)胞胚胎的囊胚發(fā)育率和體外培養(yǎng)48或72 h擴(kuò)張囊胚率沒(méi)有顯著影響,但是,高濃度的PAF(9.3×10-6和18.6×10-6mol·L-1)對(duì)胚胎發(fā)育起有害作用。Lee等[19]發(fā)現(xiàn),雖然在IVC液中添加PAF不能提高豬IVF胚胎發(fā)育率,但能顯著提高豬體細(xì)胞核移植(SCNT)胚胎的囊胚率。O’Neill[16]發(fā)現(xiàn),在胚胎培養(yǎng)液中添加PAF能顯著提高小鼠的卵裂率和囊胚率。這些研究結(jié)果的不一致可能與胚胎種類(lèi)(體內(nèi)受精、IVF、SCNT)和培養(yǎng)系統(tǒng)(單位體積培養(yǎng)液中胚胎數(shù)量)的差異有關(guān)。在胚胎培養(yǎng)過(guò)程中,胚胎自分泌PAF和IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ、EGF等生長(zhǎng)因子進(jìn)入培養(yǎng)液,促進(jìn)胚胎發(fā)育[13,16],而胚胎培養(yǎng)液中這些生長(zhǎng)因子的濃度與胚胎種類(lèi)和培養(yǎng)液中胚胎濃度有關(guān)[16]。雖然本研究未測(cè)定COCs和胚胎自分泌的PAF濃度,但是單位體積IVM液中COCs的數(shù)量(每1 000 μL 30枚)和IVC液中胚胎數(shù)量(每40 μL 30枚)符合牦牛和普通牛體外受精基本規(guī)程要求[3-9],因此,篩選出的最佳PAF濃度對(duì)牦牛體外受精具有重要指導(dǎo)意義。PAF對(duì)卵泡發(fā)育和胚胎發(fā)育的作用主要通過(guò)卵泡顆粒細(xì)胞和胚胎細(xì)胞上的PAF受體(PAFr)介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)[19,37]。但是目前,PAF與PAFr結(jié)合后對(duì)基因表達(dá)影響的機(jī)制還不清楚,因此,本研究對(duì)IVM液中PAF對(duì)COCs和胚胎中與細(xì)胞凋亡和增殖相關(guān)的一些重要基因表達(dá)調(diào)控進(jìn)行了研究。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中,抗凋亡因子BCL-2和促凋亡因子BAX為細(xì)胞提供信號(hào)通路,細(xì)胞內(nèi)兩種力量的差異決定細(xì)胞凋亡與發(fā)育命運(yùn)[23-25]。本研究發(fā)現(xiàn),IVM液中PAF濃度對(duì)牦牛卵母細(xì)胞IVM過(guò)程中BCL-2和BAX的表達(dá)有一定影響,IVM中PAF濃度為10-6mol·L-1時(shí)促凋亡基因BAX表達(dá)量顯著高于其他組,而10-7mol·L-1組抗凋亡基因BCL-2表達(dá)量最高,顯著高于10-6mol·L-1組(P<0.05, 圖1)。說(shuō)明IVM液中PAF濃度過(guò)高會(huì)促進(jìn)卵母細(xì)胞凋亡,而濃度為10-7mol·L-1抗凋亡作用較強(qiáng),有利于牦牛卵母細(xì)胞成熟。表皮生長(zhǎng)因子(EGF)及其受體(EGFR)、c-fos因子等能促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化[8,16,26,29]。10-7mol·L-1組COCs中這些基因的表達(dá)水平最高,顯著高于10-6mol·L-1組(P<0.05),說(shuō)明適當(dāng)濃度的PAF可以通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化,從而促進(jìn)牦牛卵母細(xì)胞的體外成熟。有研究表明,IVM液中適宜濃度的FSH也是通過(guò)提高牦牛卵母細(xì)胞EGF、EGFR和BCL-2的表達(dá)及降低BAX的表達(dá)來(lái)提高牦牛卵母細(xì)胞的發(fā)育能力[38]。OCT-4和NANOG主要維持胚胎細(xì)胞的多能性[27-28]。與趙天等[39]的研究結(jié)果一致,OCT-4在牦牛COCs和早期胚胎發(fā)育過(guò)程中的各個(gè)時(shí)期均有表達(dá),且不同時(shí)期該基因的表達(dá)量存在差異,說(shuō)明OCT-4可能參與胚胎合子型基因轉(zhuǎn)錄激活的調(diào)控過(guò)程和維持囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)全能性的過(guò)程。
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]犏牛高效生產(chǎn)新模式的建立[J]. 熊顯榮,李鍵,字向東,蘭道亮,何世明,吳錦波,余忠華,王二耀. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2019(05)
[2]FSH對(duì)牦牛卵母細(xì)胞EGF、EGFR表達(dá)及其細(xì)胞凋亡的影響[J]. 何翃閎,潘陽(yáng)陽(yáng),張慧珠,李秦,王萌,崔燕,樊江峰,余四九. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2018(09)
[3]基于高通量測(cè)序的犏牛囊胚玻璃化冷凍損傷機(jī)制研究[J]. 鄭杰,蒲思穎,楊遠(yuǎn)瀟,王琴,楊繞芬,字向東. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2017(10)
[4]Oct 4在牦牛卵母細(xì)胞及早期胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)[J]. 趙天,李谷月,潘陽(yáng)陽(yáng),李月琴,陳平,溫澤星,崔燕,余四九. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2017(03)
[5]體外受精生產(chǎn)犏牛胚胎與移植試驗(yàn)研究[J]. 孫永剛,徐驚濤,才讓東智,馬志杰. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2013(05)
博士論文
[1]豬早期胚胎發(fā)育中體外培養(yǎng)體系優(yōu)化及OCT4、NANOG功能研究[D]. 郭詩(shī)萌.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2019
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