哺乳動(dòng)物的成功受精是動(dòng)物的種族延續(xù)和基因進(jìn)化的前提,精子與卵子的質(zhì)膜粘附并融合是哺乳動(dòng)物完成受精所必需的步驟。近年來(lái),在很多學(xué)者利用現(xiàn)代分子生物學(xué)手段對(duì)精卵質(zhì)膜粘附和融合過(guò)程進(jìn)行的研究中發(fā)現(xiàn),精卵融合是個(gè)多分子多受體的協(xié)調(diào)下共同參與發(fā)生的過(guò)程�，F(xiàn)階段普遍認(rèn)為精卵融合的起始部位為精子膜赤道區(qū),而對(duì)equatorin的研究起始于應(yīng)用MN9單克隆抗體對(duì)精子上該蛋白的識(shí)別,而且體外注射MN9抗體能顯著抑制精卵融合,初步猜想Eqtn為精卵融合相關(guān)蛋白。但是Eqtn究竟以何種方式參與頂體并最終介導(dǎo)精卵融合尚未知。本實(shí)驗(yàn)以?xún)?nèi)蒙古綿羊?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物,首先根據(jù)GenBank中已公布的相關(guān)物種Eqtn基因序列信息,對(duì)比其CDs區(qū)尋找保守序列,設(shè)計(jì)該基因的特異性引物。提取綿羊睪丸組織總RNA,通過(guò)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,以此為模板克隆Eqtn基因的cDNA,并測(cè)序。測(cè)序后,根據(jù)該cDNA的可參考序列,設(shè)計(jì)特異性引物克隆去掉信號(hào)肽后的基因片段（19aa-336aa）。將克隆得到的cDNA片段插入原核表達(dá)載體pGEX-4T-1,構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-Eqtn;將重組質(zhì)粒PGEX-Eqtn轉(zhuǎn)化E.coli BL21（... 

【文章來(lái)源】：內(nèi)蒙古大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū) 211工程院校

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
符號(hào)說(shuō)明
目錄
第一部分 文獻(xiàn)綜述
    第一章 哺乳動(dòng)物體內(nèi)精卵融合機(jī)制的研究進(jìn)展
        1. 哺乳動(dòng)物的精卵融合機(jī)制
            1.1. 精卵識(shí)別
            1.2. 頂體反應(yīng)
            1.3. 精卵融合
        2. 精卵融合的分子基礎(chǔ)
            2.1. 卵膜表面分子
            2.2. 精子表面分子
        3. 精卵融合的生物學(xué)意義
    第二章 赤道素Eqtn的研究進(jìn)展
        1. Eqtn的基本概況
            1.1. Eqtn的發(fā)現(xiàn)
            1.2. Eqtn的定位
        2. Eqtn的研究意義
第二部分 研究論文
    第一章 綿羊Eqtn cDNA的克隆及生物信息學(xué)分析
        前言
        1. 材料與方法
            1.1. 試驗(yàn)動(dòng)物
            1.2. 儀器與試劑
                1.2.1. 實(shí)驗(yàn)儀器
                1.2.2. 試劑
                1.2.3. 克隆載體
                1.2.4. 菌種
                1.2.5. 試劑配制
                1.2.6. 器具處理
            1.3. 引物的合成與保存
                1.3.1. 特異性引物的設(shè)計(jì)與合成
                1.3.2. 引物的保存和稀釋
            1.4. 實(shí)驗(yàn)方法
                1.4.1. 綿羊睪丸組織總RNA提取
                1.4.2. cDNA第一條鏈的合成
                1.4.3. β-actin檢測(cè)模板
                1.4.4. PCR擴(kuò)增
                1.4.5. 回收PCR產(chǎn)物
                1.4.6. 目的片段與T-載體的連接
                1.4.7. 轉(zhuǎn)化與篩選
                1.4.8. 重組質(zhì)粒T-Eqtn的鑒定
            1.5. Eqtn基因的生物信息學(xué)分析
                1.5.1. 結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與功能分析
                1.5.2. 分子系統(tǒng)進(jìn)化分析
        2. 結(jié)果
            2.1. 絨山羊與綿羊睪丸組織總RNA的提取與鑒定
            2.2. 絨山羊與綿羊cDNA的β-actin檢測(cè)
            2.3. 絨山羊Eqtn cDNA全長(zhǎng)的PCR擴(kuò)增
            2.4. 重組質(zhì)粒的鑒定
            2.5. 分析測(cè)序結(jié)果
                2.5.1. 測(cè)序結(jié)果
                2.5.2. 核酸序列比對(duì)
                2.5.3. 氨基酸序列比對(duì)
            2.6. 綿羊Eqtn基因的生物信息學(xué)分析
                2.6.1. 結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與功能分析
                2.6.2. 分子系統(tǒng)進(jìn)化分析
        3. 討論
    第二章 重組蛋白GST-Eqtn蛋白的原核表達(dá)及純化
        前言
        1. 材料與方法
            1.1. 儀器與試劑
                1.1.1. 實(shí)驗(yàn)儀器
                1.1.2. 實(shí)驗(yàn)試劑
                1.1.3. 常用試劑配制
                1.1.4. 菌種
                1.1.5. 載體
            1.2. 實(shí)驗(yàn)方法
                1.2.1. 引物設(shè)計(jì)與合成
                1.2.2. 擴(kuò)增目的片段
                1.2.3. 電泳鑒定及產(chǎn)物回收
                1.2.4. 構(gòu)建重組質(zhì)粒PGEX-Eqtn
                1.2.5. 融合蛋白GST-Eqtn的原核表達(dá)
                1.2.6. 融合蛋白GST-Eqtn的SDS-PAGE電泳鑒定
                1.2.7. 融合蛋白GST-Eqtn的Western Bloting鑒定
                1.2.8. 融合蛋白GST-Eqtn的純化與濃縮
                1.2.9. Bardford法測(cè)定純化蛋白的濃度
        2. 結(jié)果
            2.1. 目的片段的克隆與回收
            2.2. 構(gòu)建過(guò)渡載體T-Eqtn
            2.3. 構(gòu)建表達(dá)載體PGEX-Eqtn
            2.4. 重組質(zhì)粒的測(cè)序鑒定
            2.5. 融合蛋白GST-Eqtn的原核表達(dá)與純化
            2.6. 融合蛋白GST-Eqtn的Western Bloting檢測(cè)
            2.7. 融合蛋白GST-Eqtn的Bardford法濃度測(cè)定結(jié)果
        3. 討論
    第三章 小鼠抗絨山羊GST-Eqtn腹水多克隆抗體的制備與檢測(cè)
        前言
        1. 材料與方法
            1.1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
            1.2. 儀器與試劑
                1.2.1. 實(shí)驗(yàn)儀器
                1.2.2. 實(shí)驗(yàn)材料
                1.2.3. 細(xì)胞
            1.3. 實(shí)驗(yàn)方法
                1.3.1. 腹水瘤細(xì)胞S180的培養(yǎng)
                1.3.2. 小鼠抗Eqtn多克隆抗體的制備與鑒定
                1.3.3. 自制多克隆抗體的蛋白特異性檢測(cè)
                1.3.4. 自制多克隆抗體效價(jià)測(cè)定
        2. 結(jié)果
            2.1. 小鼠抗GST-Eqtn腹水多克隆抗體的鑒定
            2.2. 小鼠抗GST-Eqtn腹水多克隆抗體的效價(jià)測(cè)定
        3. 討論
    第四章 對(duì)綿羊睪丸組織及綿羊精子中Eqtn蛋白的定位檢測(cè)
        前言
        1. 材料與方法
            1.1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
            1.2. 儀器與試劑
                1.2.1. 實(shí)驗(yàn)儀器
                1.2.2. 實(shí)驗(yàn)材料
                1.2.3. 常用試劑配制
            1.3. 實(shí)驗(yàn)方法
                1.3.1. 綿羊睪丸組織石蠟切片的制作
                1.3.2. 免疫組織化學(xué)染色
                1.3.3. 頂體反應(yīng)前后Eqtn在精子中的定位
        2. 結(jié)果
            2.1. Eqtn蛋白在綿羊精子中的定位
            2.2. Eqtn蛋白在睪丸組織中的定位
        3. 討論
參考文獻(xiàn)
致謝
讀碩士期間參與的科研項(xiàng)目與發(fā)表的論文



本文編號(hào)：3357290