哺乳動物的成功受精是動物的種族延續(xù)和基因進化的前提,精子與卵子的質(zhì)膜粘附并融合是哺乳動物完成受精所必需的步驟。近年來,在很多學者利用現(xiàn)代分子生物學手段對精卵質(zhì)膜粘附和融合過程進行的研究中發(fā)現(xiàn),精卵融合是個多分子多受體的協(xié)調(diào)下共同參與發(fā)生的過程�，F(xiàn)階段普遍認為精卵融合的起始部位為精子膜赤道區(qū),而對equatorin的研究起始于應(yīng)用MN9單克隆抗體對精子上該蛋白的識別,而且體外注射MN9抗體能顯著抑制精卵融合,初步猜想Eqtn為精卵融合相關(guān)蛋白。但是Eqtn究竟以何種方式參與頂體并最終介導(dǎo)精卵融合尚未知。本實驗以內(nèi)蒙古綿羊為實驗動物,首先根據(jù)GenBank中已公布的相關(guān)物種Eqtn基因序列信息,對比其CDs區(qū)尋找保守序列,設(shè)計該基因的特異性引物。提取綿羊睪丸組織總RNA,通過反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,以此為模板克隆Eqtn基因的cDNA,并測序。測序后,根據(jù)該cDNA的可參考序列,設(shè)計特異性引物克隆去掉信號肽后的基因片段（19aa-336aa）。將克隆得到的cDNA片段插入原核表達載體pGEX-4T-1,構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pGEX-Eqtn;將重組質(zhì)粒PGEX-Eqtn轉(zhuǎn)化E.coli BL21（... 

【文章來源】：內(nèi)蒙古大學內(nèi)蒙古自治區(qū) 211工程院校

【文章頁數(shù)】：81 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
符號說明
目錄
第一部分 文獻綜述
    第一章 哺乳動物體內(nèi)精卵融合機制的研究進展
        1. 哺乳動物的精卵融合機制
            1.1. 精卵識別
            1.2. 頂體反應(yīng)
            1.3. 精卵融合
        2. 精卵融合的分子基礎(chǔ)
            2.1. 卵膜表面分子
            2.2. 精子表面分子
        3. 精卵融合的生物學意義
    第二章 赤道素Eqtn的研究進展
        1. Eqtn的基本概況
            1.1. Eqtn的發(fā)現(xiàn)
            1.2. Eqtn的定位
        2. Eqtn的研究意義
第二部分 研究論文
    第一章 綿羊Eqtn cDNA的克隆及生物信息學分析
        前言
        1. 材料與方法
            1.1. 試驗動物
            1.2. 儀器與試劑
                1.2.1. 實驗儀器
                1.2.2. 試劑
                1.2.3. 克隆載體
                1.2.4. 菌種
                1.2.5. 試劑配制
                1.2.6. 器具處理
            1.3. 引物的合成與保存
                1.3.1. 特異性引物的設(shè)計與合成
                1.3.2. 引物的保存和稀釋
            1.4. 實驗方法
                1.4.1. 綿羊睪丸組織總RNA提取
                1.4.2. cDNA第一條鏈的合成
                1.4.3. β-actin檢測模板
                1.4.4. PCR擴增
                1.4.5. 回收PCR產(chǎn)物
                1.4.6. 目的片段與T-載體的連接
                1.4.7. 轉(zhuǎn)化與篩選
                1.4.8. 重組質(zhì)粒T-Eqtn的鑒定
            1.5. Eqtn基因的生物信息學分析
                1.5.1. 結(jié)構(gòu)預(yù)測與功能分析
                1.5.2. 分子系統(tǒng)進化分析
        2. 結(jié)果
            2.1. 絨山羊與綿羊睪丸組織總RNA的提取與鑒定
            2.2. 絨山羊與綿羊cDNA的β-actin檢測
            2.3. 絨山羊Eqtn cDNA全長的PCR擴增
            2.4. 重組質(zhì)粒的鑒定
            2.5. 分析測序結(jié)果
                2.5.1. 測序結(jié)果
                2.5.2. 核酸序列比對
                2.5.3. 氨基酸序列比對
            2.6. 綿羊Eqtn基因的生物信息學分析
                2.6.1. 結(jié)構(gòu)預(yù)測與功能分析
                2.6.2. 分子系統(tǒng)進化分析
        3. 討論
    第二章 重組蛋白GST-Eqtn蛋白的原核表達及純化
        前言
        1. 材料與方法
            1.1. 儀器與試劑
                1.1.1. 實驗儀器
                1.1.2. 實驗試劑
                1.1.3. 常用試劑配制
                1.1.4. 菌種
                1.1.5. 載體
            1.2. 實驗方法
                1.2.1. 引物設(shè)計與合成
                1.2.2. 擴增目的片段
                1.2.3. 電泳鑒定及產(chǎn)物回收
                1.2.4. 構(gòu)建重組質(zhì)粒PGEX-Eqtn
                1.2.5. 融合蛋白GST-Eqtn的原核表達
                1.2.6. 融合蛋白GST-Eqtn的SDS-PAGE電泳鑒定
                1.2.7. 融合蛋白GST-Eqtn的Western Bloting鑒定
                1.2.8. 融合蛋白GST-Eqtn的純化與濃縮
                1.2.9. Bardford法測定純化蛋白的濃度
        2. 結(jié)果
            2.1. 目的片段的克隆與回收
            2.2. 構(gòu)建過渡載體T-Eqtn
            2.3. 構(gòu)建表達載體PGEX-Eqtn
            2.4. 重組質(zhì)粒的測序鑒定
            2.5. 融合蛋白GST-Eqtn的原核表達與純化
            2.6. 融合蛋白GST-Eqtn的Western Bloting檢測
            2.7. 融合蛋白GST-Eqtn的Bardford法濃度測定結(jié)果
        3. 討論
    第三章 小鼠抗絨山羊GST-Eqtn腹水多克隆抗體的制備與檢測
        前言
        1. 材料與方法
            1.1. 實驗動物
            1.2. 儀器與試劑
                1.2.1. 實驗儀器
                1.2.2. 實驗材料
                1.2.3. 細胞
            1.3. 實驗方法
                1.3.1. 腹水瘤細胞S180的培養(yǎng)
                1.3.2. 小鼠抗Eqtn多克隆抗體的制備與鑒定
                1.3.3. 自制多克隆抗體的蛋白特異性檢測
                1.3.4. 自制多克隆抗體效價測定
        2. 結(jié)果
            2.1. 小鼠抗GST-Eqtn腹水多克隆抗體的鑒定
            2.2. 小鼠抗GST-Eqtn腹水多克隆抗體的效價測定
        3. 討論
    第四章 對綿羊睪丸組織及綿羊精子中Eqtn蛋白的定位檢測
        前言
        1. 材料與方法
            1.1. 實驗動物
            1.2. 儀器與試劑
                1.2.1. 實驗儀器
                1.2.2. 實驗材料
                1.2.3. 常用試劑配制
            1.3. 實驗方法
                1.3.1. 綿羊睪丸組織石蠟切片的制作
                1.3.2. 免疫組織化學染色
                1.3.3. 頂體反應(yīng)前后Eqtn在精子中的定位
        2. 結(jié)果
            2.1. Eqtn蛋白在綿羊精子中的定位
            2.2. Eqtn蛋白在睪丸組織中的定位
        3. 討論
參考文獻
致謝
讀碩士期間參與的科研項目與發(fā)表的論文



本文編號：3357290