豬瘟（Classical swine fever,CSF）是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）引起的一種高度接觸性致死性傳染病,現(xiàn)階段,豬瘟的防控通常采用豬瘟兔化弱毒疫苗（C株）進行接種預防,該疫苗是世界上公認的最有效和安全的弱毒疫苗,對豬瘟的防控起到了重要的作用。然而,在免疫良好的豬場仍有豬瘟的病例的發(fā)生,CSFV與牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）同屬于黃病毒科、瘟病毒屬,存在抗原相關(guān)性和交叉反應性,兩者自然條件下感染豬,其臨床癥狀和病理變化相似,加大了臨床診斷的困難。為了解山東地區(qū)CSFV的流行狀況和更好地進行CSFV的監(jiān)測,本試驗建立了雙重熒光RT-PCR（RT-qPCR）檢測方法,并對成功分離的CSFV的C、E0、E1基因和E2部分基因進行了克隆測序和遺傳進化分析。為建立CSFV和BVDV的鑒別檢測方法,根據(jù)Genbank公布的基因序列設計特異性引物和TaqMan探針,以構(gòu)建的CSFV Npro和BVDV 5′-UTR的陽性重組質(zhì)粒作為陽性質(zhì)控品,優(yōu)化反應條件,建立了雙重RT-qPC... 

【文章來源】：山東農(nóng)業(yè)大學山東省

【文章頁數(shù)】：64 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

BVDV5′-UTR基因的RT-PCR擴增Fig.2RT-PCRamplificationofBVDVgene5′-UTR

CSFV/BVDV 雙重 RT-qPCR 方法建立的結(jié)果1 陽性質(zhì)控品的制備及濃度確定通過 RT-PCR 獲得了 CSFV Npro和 BVDV 5′-UTR 區(qū)域，為 592bp 和，與預期大小一致（圖 1 和圖 2）。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入 DH5α提取質(zhì)粒進行測序。測序正確后，選用限制性內(nèi)切酶，對 30μl 質(zhì)粒將 DNA 片段進行回收，溶于 30μl Nuclease-Free 水中作為模板，用 Pro MAXTM Large Scale RNAProduction System-T7 試劑盒進行體外轉(zhuǎn)錄溫浴 5 小時。之后向反應體系中加入 10μl RQ1 DNA 酶，37℃溫育 A 模板。最后用 TRIZOL 重新提取純化 RNA，以去除體系中的雜蛋白 cDNA 濃度分別為 1.5x1011/μl (CSFV)、8.2x1010/μl（BVDV）。將用稀釋液稀釋成 108copies/μl 后，作為陽性質(zhì)控品。

山東農(nóng)業(yè)大學全日制碩士專業(yè)學位論文反應條件為：反轉(zhuǎn)錄 42℃ 30min；預變性 94℃ 3min；92℃ 15s，45℃ 30s，1min ，5 個循環(huán)；92℃ 10s，56℃ 1min（收集熒光），40 個循環(huán)。標準曲線建立，將連續(xù) 10 倍倍比稀釋的 CSFV 和 BVDV 陽性質(zhì)控品（cDNA分別為 106、105、104、103、102/μl）用建立的熒光 RT-PCR 檢測方法進行檢測，采光 PCR 儀軟件 Roche LightCycler Softwire Version3.5 對 Ct 值和樣品中 cDNA 的量線性回歸分析，建立標準曲線，其中 CSFV、BVDV 的相關(guān)系數(shù) R2=0.99(圖 3 和圖BVDV-F（10μmol/ L） 0.5μlBVDV-R（10μmol/ L） 1μlBVDV-Probe（10μmol/ L） 0.5μlDEPC H2O 2.75μlRNA 模板 10μl

【參考文獻】：
期刊論文
[1]2016年豬病流行情況與2017年流行趨勢及防控對策[J]. 楊漢春,周磊.  豬業(yè)科學. 2017(02)
[2]豬瘟病毒檢測方法研究進展[J]. 諸婷婷,郝彥龍,袁小平,但文靜,唐維英.  甘肅畜牧獸醫(yī). 2017(01)
[3]福建地區(qū)豬瘟病毒流行株基因分型及E2基因遺傳變異分析[J]. 魏春華,劉建奎,戴愛玲,曾宇坤,李曉華,楊小燕.  中國獸醫(yī)學報. 2016(12)
[4]豬瘟病毒E0和E2基因變異及豬瘟凈化方法的研究[J]. 韋冠東,馬萍,湯德元,張元鑫,劉霞,曾智勇,李達,李謙.  豬業(yè)科學. 2016(06)
[5]豬瘟病毒石門株在ST細胞連續(xù)傳代后E0基因變異分析[J]. 孫永科,胡超英,林明星,陸欣然,楊玉艾.  動物醫(yī)學進展. 2016(06)
[6]豬瘟病毒E0蛋白在PK-15中的表達與鑒定[J]. 周景明,劉芳冰,祁艷華,張改平,栗寧,王愛萍.  安徽農(nóng)業(yè)科學. 2016(10)
[7]仔豬豬瘟母源抗體的消長規(guī)律及免疫程序制定[J]. 姚俊庸,吉藝寬,鄭仲華.  廣東畜牧獸醫(yī)科技. 2016(02)
[8]豬用疫苗中牛病毒性腹瀉病毒污染的檢測與分析[J]. 張志,張美晶,董雅琴,王佳,吳發(fā)興,劉爽,邵衛(wèi)星,李曉成,王樹雙.  中國動物檢疫. 2015(11)
[9]豬瘟病毒衣殼蛋白與宿主細胞核仁素蛋白相互作用[J]. 張鑫,時洪艷,徐佳.  中國預防獸醫(yī)學報. 2015(06)
[10]一步法CSFV和PRRSV雙重實時熒光定量RT-PCR診斷方法的建立與初步應用[J]. 袁秀芳,路斌,徐麗華,李軍星,王一成.  浙江農(nóng)業(yè)學報. 2015(04)

博士論文
[1]規(guī)�；i場豬瘟疫苗群體免疫程序的研究[D]. 陳果亮.湖南農(nóng)業(yè)大學 2013
[2]我國部分地區(qū)豬源牛病毒性腹瀉病毒研究[D]. 鄧宇.四川農(nóng)業(yè)大學 2012
[3]中國豬瘟流行病學現(xiàn)狀與防制研究[D]. 涂長春.中國農(nóng)業(yè)大學 2004
[4]中國豬瘟兔化弱毒（脾淋毒）全長感染性cDNA的分子克隆[D]. 胡建和.西北農(nóng)林科技大學 2003
[5]豬瘟病毒E2基因遺傳變異及體外表達研究[D]. 韓雪清.西北農(nóng)林科技大學 2002

碩士論文
[1]CSFV、BVDV雙重RT-PCR檢測方法的建立及E2基因遺傳進化分析[D]. 秦為堅.華南農(nóng)業(yè)大學 2016
[2]2014-2015年我國豬瘟病毒的分子流行病學分析[D]. 馮麗蘋.長江大學 2016
[3]泰安某豬場豬瘟病毒的檢測及疫苗免疫效果評價[D]. 朱應平.山東農(nóng)業(yè)大學 2016
[4]鑒別GSFV與BVDV1雙重實時熒光定量PCR方法的建立[D]. 海日汗.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 2015
[5]豬瘟病毒核衣殼蛋白C亞細胞定位信號的鑒定[D]. 劉寧.吉林農(nóng)業(yè)大學 2014
[6]廣東省部分地區(qū)豬瘟分子流行病學調(diào)查[D]. 彭志成.山東農(nóng)業(yè)大學 2013
[7]2012年豬瘟E2基因分子流行病學調(diào)查及重組病毒構(gòu)建[D]. 王賽賽.福建農(nóng)林大學 2013
[8]山東省豬瘟流行病學調(diào)查及流行毒株Erns基因變異分析[D]. 黨安坤.山東農(nóng)業(yè)大學 2012
[9]豬源牛病毒性腹瀉病毒RT-PCR檢測方法的建立及表達BVDV保護性抗原重組豬痘病毒的構(gòu)建[D]. 蒙明璐.南京農(nóng)業(yè)大學 2012
[10]豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白E0、E2和非結(jié)構(gòu)蛋白Npro、NS4A的原核表達及純化[D]. 高璐璐.中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院 2011



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