為探究牦牛中性粒細(xì)胞β防御素4（BNBD4）在牦牛組織中的分布情況以及BNBD4的蛋白特性,本研究采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得牦牛BNBD4基因序列,利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)與功能,結(jié)果顯示,牦牛BNBD4基因開放閱讀框?yàn)?95 bp,編碼64個(gè)氨基酸,其序列與黃牛和水牛的相似性分別為96.4%和87.7%,其在同屬中具有高度的保守性。蛋白功能與結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,該蛋白屬于分泌型陽離子β防御素,其可與病原體的磷脂膜結(jié)合,從而破壞病原體細(xì)胞膜的完整性。通過熒光定量PCR檢測(cè)BNBD4在牦牛5種組織中的轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)果顯示該基因在牦牛腎臟的轉(zhuǎn)錄水平極顯著高于心、肝、脾和肺（p<0.01）,其次該基因在肝臟中的轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)較高。構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-BNBD4并誘導(dǎo)表達(dá),對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE和western blot鑒定分析,結(jié)果顯示,BNBD4重組蛋白在大腸桿菌中以包涵體形式表達(dá),重組蛋白約為23 ku。進(jìn)一步將pET32a-BNBD4/BL21（DE3）經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后于LB平板過夜培養(yǎng),觀察各組菌落數(shù),分析BNBD4對(duì)E. coli BL21（DE3... 

【文章來源】：中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2020,42(10)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

重組質(zhì)粒p ET32a-BNBD4酶切鑒定

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3）感受態(tài)細(xì)胞，誘導(dǎo)12 h后收集表達(dá)產(chǎn)物，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，出現(xiàn)大小約為23 ku的重組蛋白，而陰性對(duì)照在相應(yīng)位置未見明顯條帶（圖5A）。目的蛋白存在于破碎后的沉淀中，表明該蛋白主要以包涵體形式表達(dá)。Western blot鑒定結(jié)果顯示明顯的特異性蛋白印跡帶（圖5B）。表明正確表達(dá)了BNBD4重組蛋白。2.7 重組蛋白BNBD4的毒性試驗(yàn)

重組蛋白BNBD4對(duì)大腸桿菌的毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示，5×107cfu/m L、5×106cfu/m L、5×105cfu/m L、5×104cfu/m L濃度的重組菌菌落均明顯少于對(duì)照組（圖6），表明重組蛋白BNBD4對(duì)大腸桿菌BL21(DE3）具有明顯的抑制作用。3 討論

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]藍(lán)狐β-防御素1基因（vBD1）的真核表達(dá)及其抑菌活性分析[J]. 鐵宇娟,劉陶林,蔡卉,王東陽,劉志平,田麗紅.  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2019(05)
[2]小鼠β防御素4體外對(duì)人呼吸道合胞病毒抑制作用研究[J]. 張科,林勇平,劉興德,胡志偉,牟榮,吳家紅,羅語思.  中國病原生物學(xué)雜志. 2018(07)
[3]牛源防御素類抗菌肽的生物信息學(xué)分析[J]. 張煒,杭柏林,董萌萌,胡斌,徐彥召,張慧輝,胡建和.  現(xiàn)代畜牧獸醫(yī). 2018(07)
[4]川芎嗪對(duì)LPS致傷奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的TLR4和BNBD4 mRNA表達(dá)的影響[J]. 王自力,蔣會(huì)會(huì),張翥,魏學(xué)良,別應(yīng)堂,張家驊.  中國獸藥雜志. 2015(12)
[5]β防御素在牛健康組織和病變組織中的分布[J]. 楊宇琴,王細(xì)花,呂悅,程廣宇,周向梅.  畜牧與獸醫(yī). 2015(12)
[6]人β防御素4對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖凋亡及Caspase-3蛋白表達(dá)的影響[J]. 曹玉紅,張靜怡,張光運(yùn),曹艷華.  西部醫(yī)學(xué). 2015(05)
[7]荷斯坦奶牛乳腺β-防御素的差異表達(dá)[J]. 程蘭玲,曹貴方,溫世勇,趙鵬偉,關(guān)洪敏,菅瑞珍.  中國畜牧獸醫(yī). 2012(06)
[8]鴨β-防御素4cDNA的克隆、表達(dá)及其抑菌活性的初步分析[J]. 藺利娟,韓宗璽,邵昱昊,張可心,劉勝旺,李子瑞,馬得瑩.  畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2011(09)
[9]重組人β防御素4的原核表達(dá)、純化及抗銅綠假單胞菌活性初探[J]. 甘曉琴,伍素華,羅向東,楊成,吳燕.  第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào). 2009(10)
[10]牦牛分類地位研究概述[J]. 李齊發(fā),趙興波,劉紅林,李寧,謝莊.  動(dòng)物分類學(xué)報(bào). 2006(03)

博士論文
[1]牛中性粒細(xì)胞β-防御素4和5成熟肽的畢赤酵母表達(dá)及其抗分枝桿菌活性研究[D]. 康靜靜.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014

碩士論文
[1]雞β-防御素Gal-4基因的原核表達(dá)及重組蛋白抑菌活性檢測(cè)[D]. 史瑞軍.塔里木大學(xué) 2019
[2]奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定及β-防御素4和5對(duì)其抑菌活性研究[D]. 李麗好.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018



本文編號(hào)：3339794