豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea,PED）是由冠狀病毒科的α冠狀病毒亞科豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的一種強感染致病性的傳染病,該病能夠引起各年齡段豬水樣腹瀉、嘔吐和仔豬高死亡率,自2010年P(guān)ED在我國大范圍流行,給養(yǎng)豬業(yè)造成重大損失。本課題研究PEDV感染對細胞周期的影響及其相關(guān)機制,分析PEDV對Vero細胞周期的調(diào)控機制及周期阻滯對PEDV的增殖和致病性的影響,從而為揭示PEDV的分子致病機制及PED防控提供了理論支撐。本研究首先對PEDV與Vero細胞的相互作用進行研究,通過MTT法檢測PEDV復制對Vero細胞活力的影響,確定本次研究PEDV感染劑量0.5 MOI,Vero細胞收集時間段為0、6、12、18、24h。用本試驗室分離保存的0.5 MOI PEDV分別感染異步化和同步化的Vero細胞,胰酶消化收集感染不同時間段細胞,利用PI-BrdU雙染法處理細胞,使用流式細胞術(shù)檢測PEDV對Vero細胞周期的影響,結(jié)果顯示PEDV引起Vero細胞周期阻滯在G0/G1期。為了進一... 

【文章來源】：安徽農(nóng)業(yè)大學安徽省

【文章頁數(shù)】：59 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

PEDV病毒粒子模型圖

等從 50 份陽性病料中分離到 2 株 PEDV 病毒(ISU13-22038 和 ISU13-19338E)[34]；2014年，Tomoichiro等從88份PEDV陽性病料中成功分離到9株可以穩(wěn)定傳代的PEDV[35]；2014 年 9 月，韓國學者從 57 份陽性病料中分離到 1 株 KNU-141112 PEDV[36]，這種情況的出現(xiàn)在很大程度上限制著 PEDV 分子生物學研究的成長，亟待解決 PEDV 體外培養(yǎng)對細胞的適應性。1.5 PEDV 基因組結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白的功能PEDV 是雙囊膜、單股線性，全長約 28033nt 的正鏈 RNA。PEDV 具有冠狀病毒共有的基因組結(jié)構(gòu)，如圖 1-2 所示從 5’端-3’端 PEDV 的基因組結(jié)構(gòu)依次為：5’端是由帽子結(jié)構(gòu)(cap)、前導序列(L)和 Kozak 序列(GUUCaugC)組成的長度約為 296nt；大小約20346nt的編碼復制酶多聚非結(jié)構(gòu)蛋白占5’端2/3基因組的(12354ntORFla和8037ntORF1b)；占 3’端 1/3 的基因組包括 150-220kDa 纖突蛋白(S)、ORF3、7kDa 小膜蛋白(E)、20-30kDa 膜糖蛋白(M)和 58kDa 核衣殼蛋白(N)；3’端是由 8 個堿基(GGAAGAGC)構(gòu)成的保守序列和 1 個 Poh(A)尾構(gòu)成的大小約為 334nt。PEDV 基因組從頭到尾結(jié)構(gòu)次序為：5’-Rep-S-ORF3-E-M-N-3’，且相鄰基因之間有基因間隔序列(IS)，對 PEDV 的復制和翻譯其重要作用[37-39]。

圖 1-3 真核細胞周期概述[60]Fig 1-3 Overview of the eukaryotic cell cycle2.1 細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶(CDKs)CDKs 是參與細胞周期調(diào)控的主要蛋白，根據(jù)蛋白的組成和功能可以將其歸納在絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族里面。截止現(xiàn)在已被挖掘并命名的 CDKs 家族具有 13 個成員組織：CDK1-CDK13，其中參與細胞周期進程的 CDKs 主要包含 5 個，分別為：推動細胞由 G0 期進入 G1 期的 CDK2、CDK4 和 CDK6；推動細胞由 G1 期晚期進入到 S 期的 CDK2；在 G2/M 期中具有高度酶活性的 CDK1(CDK2)；通過與細胞周期蛋白 H 偶聯(lián)而具備擁有激酶活性的 CDK7[60]。CDKs 產(chǎn)生的升高或降低受到 Cyclins 的調(diào)節(jié)。當 CDKs 與 Cyclin 結(jié)合形成結(jié)合物進一步刺激 CDKs 的活性進而調(diào)整細胞的基因組復制和有絲分裂促進細胞周期的轉(zhuǎn)換。CDK1 又被叫做 CDC2 或者 CDK28A，具有高度的保守性，可以與 Cyclin A 或 B結(jié)合來促進細胞周期 S/G2 或 G2/M 的轉(zhuǎn)換同時也表現(xiàn)絲氨酸/蘇氨酸激酶的作用，在調(diào)控細胞周期進程中占重要地位。有研究表明，在敲除小鼠 CDK1 基因后，其細胞周

【參考文獻】：
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本文編號：3338062