通常認(rèn)為,卵泡抑素（Follistatin, FST）作為一種活化素結(jié)合蛋白,參與調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物卵泡發(fā)育,但其是否能通過(guò)自分泌作用直接調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞和卵泡的發(fā)育,尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。為了研究卵泡抑素對(duì)黃牛顆粒細(xì)胞的調(diào)控作用,本研究構(gòu)建卵泡抑素RNA干擾載體RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen,在mRNA和蛋白水平干擾牛顆粒細(xì)胞中卵泡抑素的表達(dá),發(fā)現(xiàn)在干擾卵泡抑素表達(dá)后：（1）流式細(xì)胞儀檢測(cè)黃牛顆粒細(xì)胞的周期發(fā)現(xiàn),更多的細(xì)胞阻滯在G1期,控制細(xì)胞周期的p21基因蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)；（2）流式細(xì)胞儀檢測(cè)顆粒細(xì)胞的凋亡發(fā)現(xiàn),細(xì)胞早期和晚期凋亡都顯著增加,通過(guò)RT-PCR和Western Blot分析凋亡相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn),Caspase-3和BAX的表達(dá)水平顯著上調(diào),而B(niǎo)cl-2的表達(dá)水平則顯著下調(diào)；（3）ELISA檢測(cè)顆粒細(xì)胞分泌活化素、雌激素和孕激素濃度發(fā)現(xiàn),活化素分泌顯著上調(diào),雌激素分泌量顯著下降,而孕激素變化不顯著；（4）通過(guò)RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后顆粒細(xì)胞中活化素受體及抑制素各亞基的mRNA水平,發(fā)現(xiàn)所有活化素受體（ACVR1.ACVR2A和ACVR2B）以及抑制素... 

【文章來(lái)源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：56 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語(yǔ)表
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 卵泡抑素的研究進(jìn)展
        1.1.1 卵泡抑素基本結(jié)構(gòu)
        1.1.2 卵泡抑素的生理作用
    1.2 卵泡抑素在顆粒細(xì)胞凋亡和卵泡閉鎖中可能的機(jī)制
        1.2.1 活化素誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞的凋亡
        1.2.2 卵泡抑素與活化素相互作用機(jī)制
    1.3 卵泡抑素的主要研究手段進(jìn)展
        1.3.1 卵泡抑素主要研究方法
        1.3.2 RNA干擾技術(shù)研究卵泡抑素
    1.4 本試驗(yàn)?zāi)康募耙饬x
2 材料
    2.1 試驗(yàn)細(xì)胞
    2.2 干擾載體
    2.3 主要試劑及耗材
    2.4 主要試劑盒
    2.5 主要抗體
    2.7 主要實(shí)驗(yàn)儀器
    2.8 試劑的配置
3 方法
    3.1 黃牛顆粒細(xì)胞的分離與培養(yǎng)
    3.2 黃牛顆粒細(xì)胞表達(dá)FST的驗(yàn)證
        3.2.1 顆粒細(xì)胞總RNA的提取及cDNA第一鏈合成
        3.2.2 PCR擴(kuò)增FST基因
    3.3 FST基因RNA干擾載體構(gòu)建
        3.3.1 設(shè)計(jì)與合成shRNA序列
        3.3.2 退火
        3.3.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.3.4 RNA干擾質(zhì)粒的克隆與純化提取
    3.4 FST干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染黃牛顆粒細(xì)胞
        3.4.1 細(xì)胞的準(zhǔn)備
        3.4.2 確定最優(yōu)脂質(zhì)體添加量
        3.4.3 FST干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染黃牛顆粒細(xì)胞
    3.5 轉(zhuǎn)染后FST及相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量分析
        3.5.1 轉(zhuǎn)染后顆粒細(xì)胞表達(dá)卵泡抑素的干擾效率檢測(cè)
        3.5.2 檢測(cè)卵泡抑素相關(guān)基因檢測(cè)
    3.6 流式檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡
    3.7 流式檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞周期
    3.8 ELISA檢測(cè)活化素、雌激素和孕激素濃度
    3.9 轉(zhuǎn)染后卵泡抑素及凋亡和周期相關(guān)蛋白檢測(cè)
        3.9.1 顆粒細(xì)胞總蛋白的提取
        3.9.2 顆粒細(xì)胞總蛋白含量的測(cè)定
        3.9.3 SDS-PAGE電泳及蛋白成像
4 結(jié)果與分析
    4.1 驗(yàn)證顆粒細(xì)胞表達(dá)FST
    4.2 FST干擾質(zhì)粒鑒定、轉(zhuǎn)染及干擾效果
        4.2.1 FST干擾質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果
        4.2.2 最優(yōu)脂質(zhì)體添加量
        4.2.3 FST干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率
        4.2.4 兩種FST干擾質(zhì)粒對(duì)卵泡抑素干擾效果
    4.3 轉(zhuǎn)染FST干擾質(zhì)粒對(duì)黃牛顆粒細(xì)胞的影響
        4.3.1 轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞周期的影響
        4.3.2 轉(zhuǎn)染對(duì)凋亡的影響
        4.3.3 轉(zhuǎn)染對(duì)顆粒細(xì)胞類固醇激素分泌量的影響
        4.3.4 轉(zhuǎn)染對(duì)顆粒細(xì)胞抑制素各亞基及活化素受體的影響
5 討論
6 小結(jié)
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號(hào)：3335305