多能性干細(xì)胞既可以自我更新又可以分化成許多其他細(xì)胞類型，為發(fā)育生物學(xué)、細(xì)胞治療及基因修飾的研究提供了基礎(chǔ)，然而，豬的胚胎干細(xì)胞（ES）還未能建立，誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞（iPS）研究中仍存在許多問題亟待解決。利用細(xì)胞多能性標(biāo)記基因建立報告系統(tǒng)，可以為上述研究提供有價值的工具。Oct4基因是一種重要的細(xì)胞多能性標(biāo)記，被廣泛應(yīng)用于小鼠及其它物種的多能性細(xì)胞的鑒定，可以用于干細(xì)胞示蹤報告系統(tǒng)的建立。Oct4-eGFP是一種有效的細(xì)胞多能性可視化報告系統(tǒng)，轉(zhuǎn)基因豬可作為細(xì)胞多能性研究的一種有重大價值的大動物模型，有助于豬ES和iPS細(xì)胞的建立。本研究利用TALENs（Transcription activator-like effector nuclease）介導(dǎo)的同源重組，將eGFP（enhanced green fluorescent protein）定點敲入內(nèi)源性O(shè)ct4第5外顯子的終止密碼子處，利用內(nèi)源性O(shè)ct4啟動子驅(qū)動eGFP cDNA，從而更精確的示蹤內(nèi)源性O(shè)ct4的表達情況。成功建立了五指山小型豬Oct4-eGFP細(xì)胞系，通過體細(xì)胞核移植獲得了Oct4-eGFP克隆胚胎。結(jié)果如下：研... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：62 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

同源重組機制示意圖

學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章中的地位�；虼虬屑夹g(shù)的優(yōu)勢在與它能夠?qū)崿F(xiàn)外源基因的定點整和，使某一位修復(fù)或?qū)?xì)胞或動物基因組內(nèi)某一確定的基因或 DNA 序列進行人工定點突因的功能�，F(xiàn)代基因打靶技術(shù)的發(fā)展已使得對基因打靶進行時間和空間上的控細(xì)胞基因打靶效率低，因此需要采用一定的方法對陽性細(xì)胞進行富集（Sedi過基因打靶在基因靶位點引入篩選標(biāo)記如新霉素抗性基因等，可以通過藥物篩Charron et al, 1990; Schwartzberg et al, 1990）。正負(fù)篩選策略是 1988 年美國 U人建立的，不受靶基因功能和表達情況的影響（圖 1-2）。打靶載體中包含正篩選標(biāo)記 TK，前者位于同源序列內(nèi)，后者位于載體末端的同源序列外。在發(fā)生同記被引入靶位點，而 TK 不能整合入受體細(xì)胞基因靶位。隨機整合是 neo 和 TK中。neo 使發(fā)生同源重組的細(xì)胞具有對新霉素的抗性，TK 基因的表達產(chǎn)物可以有細(xì)胞毒性的核苷酸。用含有新霉素和丙氧鳥苷的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，可以排除整合的細(xì)胞株，從而提高同源重組的效率（Mansour et al, 1988）。

圖 1-3 TALENs 引起 DSB 的修復(fù)方式Fig1-3 The repair method of DSB caused by TALENs策略具有自我剪切功能的多肽序列，來源于小核糖核酸病毒家族，例炎病毒（ERAV），以及其他病毒例如豬腸病毒-1 等。2A 肽由 20列為 Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly-Pro，可以在最后兩位氨基酸種斷裂在細(xì)胞中是自發(fā)的，且不需要酶的參與（Donnelly et al, 2前認(rèn)為是在 mRNA 翻譯的過程中，2A 肽的最后兩位氨基酸殘基, 2012)，故由 2A 肽相連的兩個基因表達后可以形成兩個獨立的蛋段約 20 個氨基酸殘基的短肽，后一個蛋白的 N 端增加一個脯氨個基因的編碼區(qū)串聯(lián)，可以實現(xiàn)在一個啟動子調(diào)控下的多基因共糖體進入位點（Internal ribosome entry site, IRES）策略會導(dǎo)致后不會有這種影響。目前，已經(jīng)有許多研究利用來源于不同病毒的

【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3332416