布魯菌病是由布魯菌引起的一種人畜共患病,以流產(chǎn)和發(fā)熱為特征,嚴(yán)重威脅人類和許多動(dòng)物的健康,同時(shí)也對畜牧業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失。本研究以布魯菌Rev.I株基因組為模板,擴(kuò)增BAB基因序列,將其克隆至原核表達(dá)載體pET-30a（+）中,獲得重組質(zhì)粒pET-30a-BAB,并進(jìn)行原核表達(dá)、Western-Blot檢測及其抗體的間接ELISA方法建立。結(jié)果表明:本試驗(yàn)成功克隆并表達(dá)了 BAB基因,經(jīng)SDS-PAGE分析純化后的表達(dá)產(chǎn)物顯示,本研究獲得較純蛋白;Western-Blot試驗(yàn)表明,該基因表達(dá)蛋白可與布魯菌羊陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng),具有良好的反應(yīng)原性;隨后,以BAB蛋白作為包被抗原,建立并優(yōu)化了檢測BAB抗體的間接ELISA方法。確定最佳包被條件為:BAB蛋白包被量0.25μg/mL,血清稀釋度為1:400;封閉液為3%豬源明膠;二抗稀釋度為1:6000;顯色時(shí)間為10 min。通過對臨床40份羊血清的檢測,計(jì)算得出臨界值為0.607。當(dāng)待檢血清OD450值大于等于0.607時(shí),判定為陽性,反之則判定為陰性。建立的BAB間接ELISA方法與SAT及RBPT相比,總符合率達(dá)到77.5%。 

【文章來源】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū)

【文章頁數(shù)】：52 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖２原核表達(dá)載體的酶切鑒定??１＾１：１１？１＾１：雙酶切？０１回收產(chǎn)物８八８?２：重組質(zhì)粒??

?內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文?１９＿??３結(jié)果??３．１目的基因擴(kuò)增結(jié)果??羊種布魯菌Ｒｅｖ．ｌ株ＢＡＢ基因的片段大小為１２４２?ｂｐ，ＰＣＲ擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)１％瓊??脂糖凝膠電泳分析，與預(yù)期大小相符（圖１）。??Ｍ?１?２?３??２０００ｂｐ＾ｎ＾｜＾｜＾ｌ??７５０ｂｐ??５００ｂｐ??２５〇ｂｐ??圖１?ＰＣＲ擴(kuò)增或膠回收產(chǎn)物??Ｍ：ｍａｋｅｒ?１－３：?ＰＣＲ?擴(kuò)增?ＢＡＢ??Ｆｉｇ?．１?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｒ?ｇｅｌ?ｒｅｃｏｖｅｒｙ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ??３．２原核表達(dá)載體酶切鑒定結(jié)果??使用價(jià)？／／／和Ａ７？ｏ／核酸內(nèi)切酶將重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定后與１％的瓊脂糖凝??膠電泳進(jìn)行檢測，條帶大小和預(yù)期結(jié)果相同（見圖２）。??Ｍ?１?２??＼??３〇ｏ〇ｂｐ??２〇ｏ〇ｂＰＢ０ｓｅ??１５００ｂｐ＾＾ｆｌＨ??ｏｏｏｂｐ??７５０ｂｐ??５〇〇ｂｐ??２５０ｂｐ??ｌＯＯｂｏ?Ｉ??圖２原核表達(dá)載體的酶切鑒定??１＾１：１１？１＾１：雙酶切？０１回收產(chǎn)物８八８?２：重組質(zhì)粒??Ｆｉｇ．２?Ｅｎｚｙｍｅ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?ａｎｄ?ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｖｅｃｔｏｒｓ??

?內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文??２１??３．４重組蛋白的純化結(jié)果??收集洗脫液，�。保埃穑膛c等體積的２ｘｌ〇ａｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ均勻混合，１００°Ｃ煮５ｍｉｎ，??電泳檢測結(jié)果如圖５所示。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析顯示，得到較純蛋白。??Ｍ?１??９４ｋＤ?…??６６．２ｋＤ?ｆ??４５ｋＤ??３３ｋＤ?—??２６ｋＤ?？??２０ｋＤ??圖５目的蛋白純化后ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳圖??Ｍ：?Ｍａｒｋｅｒ?１：純化蛋白稀釋?５?倍?１２％?ＳＤＳ－ＰＡＧＥ??Ｆｉｇ?．５?ＳＤＳ－ＰＡＧＥ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｏｆ?ｐｕｒｉｆｉｅｄ?ｔａｒｇｅｔ?ｐｒｏｔｅｉｎ??３．５重組蛋白Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ檢測結(jié)果??對誘導(dǎo)３?ｈ后的重組蛋白純化后進(jìn)行Ｗｅｓｔｅｍ－Ｂｌｏｔ檢測，１４?Ｖ電壓下轉(zhuǎn)膜６０??ｍｉｎ，孵育經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室鑒定的羊布魯氏菌陽性血清，可見明顯的目的條帶，說明誘??導(dǎo)得到的重組蛋白能被ＨＲＰ標(biāo)記的羊抗鼠ＩｇＧ抗體識別，且大小與ｐＥＴ－３０ａ分子??質(zhì)量加上目標(biāo)分子蛋白質(zhì)量的重組蛋白總分子質(zhì)量相符（見圖６）。??

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]布魯氏菌病的危害及流行情況概述[J]. 李小明,田波,楊儒愛,祁光宇.  獸醫(yī)導(dǎo)刊. 2019(05)
[2]五種不同檢測方法檢測牛布魯氏菌病結(jié)果比較[J]. 張洪軍,王會(huì)敏,李秀慧,王佩琪,陳瑞蘭,趙曉光,劉國臣,張雪松.  中國畜牧獸醫(yī)文摘. 2018(06)
[3]羊布魯氏菌病4種血清學(xué)檢測方法的臨床應(yīng)用比較[J]. 藺旭光,史量全,李佳怡,郭雙,張榮榮,白皓丞,李天旭,劉鍇.  中國微生態(tài)學(xué)雜志. 2018(04)
[4]布魯菌病診療專家共識[J]. 張文宏,張躍新.  中華傳染病雜志. 2017 (12)
[5]人類布魯氏菌病的PCR診斷技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 趙越,王英,于慧,王占黎.  包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào). 2015(03)
[6]牛病毒性腹瀉病毒抗原捕獲ELISA方法的建立[J]. 范晴,謝芝勛,謝志勤,劉加波,龐耀珊,鄧顯文,謝麗基,羅思思.  動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2015(02)
[7]布魯氏菌病患者臨床特征分析[J]. 李釗,曹新娜,姜魯寧,李曉哲,山鳳蓮.  中華醫(yī)院感染學(xué)雜志. 2015(03)
[8]布魯菌病患者外周血NK細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞亞群的變化[J]. 賈宇臣,其其格,郭菊紅,趙海珍,烏云,奧敦托婭.  中華實(shí)驗(yàn)和臨床感染病雜志(電子版). 2014(05)
[9]布魯氏菌病研究進(jìn)展[J]. 施旭光,凌鋒.  浙江預(yù)防醫(yī)學(xué). 2014(06)
[10]布魯氏菌病病原學(xué)研究進(jìn)展[J]. 孫濤,趙寶,冉紅志,朱永周,許敏.  家畜生態(tài)學(xué)報(bào). 2014(01)

博士論文
[1]流產(chǎn)布魯菌BABRS22915與BABRS27735基因定向缺失株的構(gòu)建及生物學(xué)特性的研究[D]. 鮑衍清.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2017

碩士論文
[1]宿主Prdx6與生殖系統(tǒng)相關(guān)細(xì)胞內(nèi)布魯氏菌寄生關(guān)系的研究[D]. 翟菲菲.吉林大學(xué) 2019
[2]慢性布魯氏菌病患者γδT及相關(guān)淋巴細(xì)胞的表達(dá)[D]. 任倩倩.天津醫(yī)科大學(xué) 2019
[3]布魯氏菌S2疫苗免疫綿羊血清抗體消長規(guī)律研究[D]. 劉寧.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[4]布魯氏菌BP26、OMP16、CP39、SP41和eryC基因的原核表達(dá)以及檢測血清抗體的間接ELISA方法的建立[D]. 王勇.揚(yáng)州大學(xué) 2013
[5]奶牛布魯氏菌病病原分離及PCR快速檢測方法的研究[D]. 烏倫吉如嘎.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 2006



本文編號：3331582