源于人HNRPA2B1/CBX3基因座位的染色質(zhì)開放元件UCOE包含一個(gè)雙向啟動(dòng)子及無甲基化的CpG島,具有染色質(zhì)重塑功能。當(dāng)它作為調(diào)控元件連接在啟動(dòng)子的上游時(shí)能夠防止轉(zhuǎn)錄沉默,增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平。為了研究豬UCOE在臨床應(yīng)用中所發(fā)揮的功能,本試驗(yàn)篩選了豬最佳UCOE片段。首先利用人UCOE序列進(jìn)行同源比對(duì)得到豬UCOE序列。通過酶切以及RT-PCR方法得到14個(gè)不同大小位置的豬UCOE片段,將其分別與pDRIVE5-GFP-2載體連接,構(gòu)建14個(gè)不同大小的載體,轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,使用GFP2-hUCOE作為對(duì)照,24h后收集細(xì)胞,通過RT-PCR及Western blot檢測報(bào)告基因綠色熒光蛋白GFP的表達(dá)量,篩選出能使GFP基因穩(wěn)定高效表達(dá)的最佳UCOE片段,并觀察其綠色熒光持續(xù)時(shí)間。將篩選后的最佳UCOE片段插入重組質(zhì)粒pCpG-Mini-GFP中進(jìn)一步驗(yàn)證UCOE片段功能。結(jié)果顯示,構(gòu)建豬的14個(gè)重組質(zhì)粒以及GFP2-hUCOE成功在HEK293T細(xì)胞進(jìn)行了過表達(dá)。與對(duì)照組GFP2-hUCOE相比,p6號(hào)質(zhì)粒GFP的相對(duì)表達(dá)量最高,且綠色熒光時(shí)間持續(xù)14天,表明p6號(hào)質(zhì)... 

【文章來源】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)河南省

【文章頁數(shù)】：53 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖１人ＨＮＲＰＡ２Ｂ１／ＣＢＸ３基因座位的結(jié)構(gòu)??Ｆｉ．ｌ?Ｔｈｅ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ＨＮＲＰＡ２Ｂ１／ＣＢＸ３ｅｎｅ?ｌｏｃｕｓ??

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)２０１４屆碩士研究生學(xué)位論文??⑤加入等體積的酚？氯仿？異戊醇（２５：２４：１），輕輕顛倒混勻。４°Ｃ，?１２０００ｒｐｍ，離心ｌＯｍｉｎ，??出現(xiàn)分層。??⑥吸取上層至新的ＥＰ管中，加３／８倍體積的１０Ｍ乙酸銨、２倍體積的冷無水乙醇，顛倒混??勻，放置－８０°Ｃ，?３０ｍｉｎ。??⑦４°Ｃ，１２０００ｒｐｍ，離心?ｌＯｍｉｎ，棄上清，留沉淀。加入?７５％乙醇?ｌｍＬ，?４°Ｃ，１２０００ｒｐｍ，??離心５ｍｉｎ，棄上清，留沉淀。??⑧加入２〇ｎＬ?ｌｘＴＥ?ｂｕｆｆｅｒ溶解沉淀，６５°Ｃ孵育６ｈ以上。加入適量ＲＮａｓｅ，?３７°Ｃ孵育ｌｈ。??通過０．８％瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組ＤＮＡ的提取質(zhì)量。－２０°Ｃ保存?zhèn)溆谩??３．２．?２．２引物設(shè)計(jì)與合成??根據(jù)同源比對(duì)出的豬ＵＣＯＥ（ｓＵＣＯＥ）序列以及其酶切位點(diǎn)所在位置（圖２琍用Ｐｒｉｍｅｒ５．０??軟件設(shè)計(jì)目的片段引物。設(shè)計(jì)的引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成（表１）。??

使用全血基因ＤＮＡ提取試劑盒提取人基因組ＤＮＡ結(jié)果見圖３。采用ＰＣＲ技術(shù)從人全血??基因組ＤＮＡ中擴(kuò)增ｈＵＣＯＥ片段，ＰＣＲ產(chǎn)物經(jīng)１％瓊脂糖凝膠電泳檢測，在１５５０ｂｐ左右有??一特異性條帶（圖４Ａ），與預(yù)計(jì)片段大小一致。ＰＣＲ產(chǎn)物與ｐＭＤ１９－Ｔ載體連接，構(gòu)建重組??質(zhì)粒ｐＭＤ１９－Ｔ－ｈＵＣＯＥ，用Ｓｍａｌ對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行單酶切，得到３５６２ｂｐ和７００ｂｐ兩個(gè)條帶，與預(yù)??期相符（圖４Ｂ）。??圖３人全血基因組ＤＮＡ的電泳圖??Ｆｉｇ．３?Ｔｈｅ?ａｇａｒｏｓｅ?ｇｅｌ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｈｕｍａｎ?ｂｌｏｏｄ?ｇｅｎｏｍｉｃ?ＤＮＡ??Ｍｌ?Ｍ２??丨．??ｉ二：；３?５６２ｂｐ??７００ｂｐ??１５５０ｂｐ？￣２??圖４?ｐＭＤ１９－Ｔ－ｈＵＣＯＥ質(zhì)粒的構(gòu)建??注：Ａ是ｈＵＣＯＥ的ＰＣＲ擴(kuò)增圖；Ｂ是ｐＭＤ１９－Ｔ－ｈＵＣＯＥ質(zhì)粒經(jīng)Ｓｍａｌ酶切鑒定圖??Ｍｌ?：ＤＬ５０００；Ｍ２：ＭａｒｋｅｒＶ??Ｆｉｇ．４?Ｔｈｅ?ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｐＭＤ１９－Ｔ－ｈＵＣＯＥ?ｐｌａｓｍｉｄ??Ｎｏｔｅ：Ａ?ｉｓ?ｔｈｅ?ＰＣＲ?ｒｅｓｕｌｔ?ｏｆ?ｈＵＣＯＥ；Ｂ?ｉｓ?ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ｐＭＤ１９－Ｔ－ｈＵＣ０Ｅ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｂｙ?Ｓｍａｌ??Ｍｌ：ＤＬ５０００；Ｍ２：ＭａｒｋｅｒＶ??４．?１．２?ＧＦＰ２－ｈＵＣＯＥ質(zhì)粒的構(gòu)建??用Ｎｓｉ丨和Ｓｄａｌ分別對(duì)ｐＭＤ１９－Ｔ－ｈＵＣＯＥ和ｐＤＲ丨ＶＥ５－ＧＦＰ－２進(jìn)行雙酶切，分別得到??１５５８ｂｐ，２７０１ｂｐ與３５８９ｂｐ特異性條帶（圖５Ａ，圖５Ｂ），與預(yù)期一致。目的片段連接，構(gòu)建??ＧＦＰ２－ｈＵＣＯＥ質(zhì)粒

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]SAR與植物轉(zhuǎn)基因沉默的消除[J]. 劉昕,傅榮昭,蔡民華,李文彬.  生物工程進(jìn)展. 1998(04)



本文編號(hào)：3324064