發(fā)布時間：2021-08-04 05:29

　　細(xì)胞色素P450酶（CYP）是一種能夠氧化多種底物的血紅素硫氫酸鹽類酶,在類固醇類物質(zhì)合成、前致癌劑激活、藥物代謝等方面發(fā)揮重要作用,最新研究表明細(xì)胞色素P450酶也參與炎癥反應(yīng)。CYP3A29是豬CYP3A亞家族的主要功能酶。豬支原體肺炎是由肺炎支原體引起的一種慢性呼吸道傳染病,本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)豬CYP3A29基因表達(dá)與肺炎支原體感染引發(fā)的炎癥反應(yīng)關(guān)系密切。目的：通過構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)CYP3A29基因的豬肺泡巨噬細(xì)胞系,探討CYP3A29基因在肺炎支原體感染炎癥反應(yīng)過程的作用。方法：RT-PCR獲取豬CYP3A29基因序列,目的片段與pMD18-T目連,得到pMD18-T-CYP3A29重組質(zhì)粒并測序驗(yàn)證,用Xhol和NotI對重組質(zhì)粒及pcDNA3.1（+）/zeo進(jìn)行雙酶切,分別獲取線性DNA片段,用T4DNA連接酶將二者連接,構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）/zeo-CYP3 A29,并對其進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證,擴(kuò)增陽性克隆,提取質(zhì)粒,并以脂質(zhì)體2000將其轉(zhuǎn)染至豬肺泡巨噬細(xì)胞系3D4/21,zeocin抗性篩選后,RT-PCR及Wesrern-blot鑒定基因表達(dá)。豬肺炎... 

【文章來源】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：100 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞
第一部分 文獻(xiàn)綜述
    第一章 豬支原體肺炎和CYP3A29基因研究進(jìn)展
        1 豬支原體肺炎研究進(jìn)展
            1.1 病原
            1.2 流行病學(xué)
            1.3 臨床癥狀
            1.4 豬肺炎支原體的黏附與致病機(jī)理
            1.5 宿主及免疫炎癥反應(yīng)
        2 細(xì)胞色素P450酶和CYP3A29基因研究進(jìn)展
            2.1 細(xì)胞色素P450酶概述
            2.2 豬細(xì)胞色素P450酶家族
                2.2.1 CYP1家族
                2.2.2 CYP2家族
                2.2.3 CYP3家族
            2.3 CYP3A29基因研究進(jìn)展
                2.3.1 CYP3A29基因的組織分布
                2.3.2 CYP3A29基因的表達(dá)和代謝特點(diǎn)
                2.3.3 CYP3A29基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)
    第二章 相關(guān)炎性細(xì)胞因子和PPAR-γ受體
        1 細(xì)胞因子與炎癥反應(yīng)
            1.1 腫瘤壞死因子
            1.2 白細(xì)胞介素-1
            1.3 白細(xì)胞介素-6
            1.4 白細(xì)胞介素-8
        2 過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)
            2.1 PPARs作用模式
            2.2 PPAR-γ相關(guān)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑
            2.3 PPAR-γ與炎癥發(fā)生相關(guān)作用機(jī)制
第二部分 實(shí)驗(yàn)研究
    第一章 穩(wěn)定表達(dá)豬CYP3A29基因的PAM細(xì)胞系構(gòu)建及鑒定
        1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1 實(shí)驗(yàn)樣品
            1.2 實(shí)驗(yàn)材料
                1.2.1 主要儀器設(shè)備
                1.2.2 主要藥品、試劑及相關(guān)溶液配制
                1.2.3 細(xì)胞、菌種及載體
        2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.1 克隆載體的構(gòu)建
                2.1.1 引物設(shè)計(jì)及合成
                2.1.2 肝臟總RNA提取
                2.1.3 RNA濃度、純度及完整性的鑒定
                2.1.4 目的基因的反轉(zhuǎn)錄
                2.1.5 PCR擴(kuò)增
                2.1.6 PCR產(chǎn)物的電泳鑒定、純化及濃度測定
                2.1.7 PCR產(chǎn)物膠回收的片段與pMD18-T載體的連接
                2.1.8 轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌
                2.1.9 陽性克隆的篩選和鑒定
            2.2 真核表達(dá)載體的構(gòu)建
                2.2.1 目的片段和載體的制備
                2.2.2 目的片段和真核表達(dá)載體的連接
                2.2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞
                2.2.4 菌液PCR、測序驗(yàn)證轉(zhuǎn)化效果
                2.2.5 無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取
                2.2.6 重組真核表達(dá)載體的雙酶切驗(yàn)證
            2.3 重組真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染PAM細(xì)胞
                2.3.1 豬肺泡巨噬細(xì)胞的復(fù)蘇
                2.3.2 豬肺泡巨噬細(xì)胞的傳代
                2.3.3 豬肺泡巨噬細(xì)胞的凍存
                2.3.4 最佳zeocin篩選濃度的確定
                2.3.5 制備不同濃度的DNA-Lipofectmine-2000復(fù)合物
                2.3.6 轉(zhuǎn)染PAM細(xì)胞
                2.3.7 zeocin抗性篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系與擴(kuò)大培養(yǎng)
                2.3.8 轉(zhuǎn)染效果的鑒定
                2.3.9 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的保存
        3 結(jié)果
            3.1 總RNA鑒定結(jié)果
            3.2 豬CYP3A29基因擴(kuò)增及克隆載體構(gòu)建
            3.3 DNA測序結(jié)果
            3.4 真核表達(dá)質(zhì)粒鑒定
            3.5 最佳zeocin篩選濃度
            3.6 RT-PCR/Western-blot檢測重組細(xì)胞株CYP3A29基因的表達(dá)
        4 討論
            4.1 豬CYP3A29基因的克隆
            4.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PAM
            4.3 豬CYP3A29高表達(dá)細(xì)胞的篩選
            4.4 轉(zhuǎn)染效果的驗(yàn)證
        小結(jié)
    第二章 CYP3A29基因在肺炎支原體感染過程中的作用
        1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1 主要儀器設(shè)備
            1.2 主要藥品、試劑、耗材
            1.3 菌株和細(xì)胞
        2 試驗(yàn)方法
            2.1 肺炎支原體感染肺泡巨噬細(xì)胞
            2.2 肺炎支原體感染肺泡巨噬細(xì)胞效果的鑒定
                2.2.1 細(xì)胞總RNA的提取
                2.2.2 反轉(zhuǎn)錄
                2.2.3 豬肺炎支原體特異性鑒定基因P36的PCR擴(kuò)增
            2.3 Real-time定量PCR
        3 數(shù)據(jù)分析
        4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
            4.1 肺炎支原體感染肺泡巨噬細(xì)胞
            4.2 肺炎支原體感染肺泡巨噬細(xì)胞效果的PCR鑒定
            4.3 攻毒后不同處理組細(xì)胞基因水平的檢測
            4.4 各處理組PPAR-γ、IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8轉(zhuǎn)錄水平比較
        5 討論
全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
發(fā)表論文



本文編號：3321098