豬支原體肺炎（Mycoplasmal pneumonia of swine, MPS）又稱豬氣喘病,是由豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae, MHP）引起的,感染豬以咳嗽和氣喘為主要癥狀的慢性呼吸道傳染病。豬群在感染MHP后,很容易繼發(fā)感染其他病原,增’加了豬病診斷和預防控制的難度。此外,MPS會導致感染豬群的飼料轉(zhuǎn)化率降低,增重減緩,嚴重危害全球養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。同其他傳染病的防治一樣,MPS的控制也主要采取免疫接種的方式。目前預防MPS的商用疫苗主要是常規(guī)滅活疫苗和弱毒疫苗。但是豬肺炎支原體的培養(yǎng)條件苛刻,制備滅活疫苗或弱毒疫苗的成本相對較高。因此,迫切需要研制出更為安全、高效、廉價的新型疫苗。挖掘豬肺炎支原體抗原蛋白,是開發(fā)新型豬肺炎支原體疫苗的關鍵。豬肺炎支原體的細胞膜在其致病過程中發(fā)揮著重要作用,而目前MHP的膜蛋白中有很大部分蛋白的功能是未知的。鑒于此,本課題以豬肺炎支原體為研究對象,對其膜蛋白中具有免疫原性的蛋白進行了篩選,旨在找到豬肺炎支原體的免疫優(yōu)勢蛋白,從而為開發(fā)亞單位疫苗和建立診斷方法奠定基礎。具體研究內(nèi)容如下：1.候選蛋白的確定運用生物信... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：74 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略語表（ABBREVIATION)
第一章 文獻綜述
    1.1 豬肺炎支原體概述
    1.2 豬肺炎支原體致病機理
    1.3 豬肺炎支原體粘附因子研究進展
        1.3.1 粘附蛋白P97
        1.3.2 粘附蛋白P102
        1.3.3 P159蛋白
        1.3.4 P216蛋白
        1.3.5 Mhp271蛋白
        1.3.6 P116蛋白
        1.3.7 Mhp107蛋白
        1.3.8 Mhp684(P146)蛋白
    1.4 豬肺炎支原體其他抗原蛋白的研究進展
        1.4.1 細胞質(zhì)蛋白P36
        1.4.2 細胞膜表面抗原蛋白P46
        1.4.3 細胞膜表面脂蛋白P65
        1.4.4 熱休克蛋白DnaK
        1.4.5 NrdF蛋白
        1.4.6 Mhp366蛋白
        1.4.7 Mhp378蛋白和Mhp651蛋白
    1.5 豬肺炎支原體疫苗研究進展
        1.5.1 常規(guī)滅活疫苗
        1.5.2 常規(guī)弱毒疫苗
        1.5.3 基因工程疫苗的研究進展
    1.6 豬支原體肺炎的綜合防制
第二章 研究目的和意義
第三章 材料與方法
    3.1 實驗材料
        3.1.1 菌株
        3.1.2 質(zhì)粒和載體
        3.1.3 工具酶及主要試劑
        3.1.4 培養(yǎng)基和抗生素及其配制
        3.1.5 主要緩沖液和試劑及其配制
        3.1.6 實驗動物
        3.1.7 主要實驗儀器及設備
    3.2 實驗方法
        3.2.0 豬肺炎支原體的培養(yǎng)
        3.2.1 支原體基因組DNA的提取
        3.2.2 候選蛋白基因的PCR擴增及密碼子SOE-PCR突變
        3.2.3 PCR產(chǎn)物或酶切產(chǎn)物回收與純化
        3.2.4 外源DNA片段與質(zhì)粒載體的連接反應
        3.2.5 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備(氯化鈣法)
        3.2.6 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
        3.2.7 重組質(zhì)粒的酶切鑒定及測序
        3.2.8 重組蛋白的原核表達和SDS-PAGE分析
        3.2.9 菌落原位免疫印跡初步篩選候選蛋白
        3.2.10 原核表達重組蛋白的純化
        3.2.11 間接ELISA分析純化的候選蛋白的反應原性
        3.2.12 小鼠實驗檢測候選蛋白的免疫原性
第四章 結(jié)果與分析
    4.1 候選研究蛋白的選取
    4.2 候選蛋白基因擴增
    4.3 候選蛋白原核表達載體構(gòu)建
    4.4 重組候選蛋白的原核表達
        4.4.1 全長候選蛋白表達
        4.4.2 去N端跨膜區(qū)序列的候選蛋白的原核表達
    4.5 菌落原位免疫印跡初步篩選候選蛋白
        4.5.1 MHP感染豬血清中大腸桿菌抗體的中和
        4.5.2 菌落原位免疫印跡初步篩選候選蛋白
        4.5.3 Western Blot進一步驗證初步篩選得到的候選蛋白
    4.6 重組候選蛋白的純化
    4.7 候選蛋白與MHP感染陽性豬血清的反應原性分析
        4.7.1 間接ELISA檢測候選蛋白與MHP感染豬血清的反應
        4.7.2 間接ELISA分析候選蛋白與疫苗免疫不同時間的豬血清的反應
    4.8 候選蛋白的免疫原性分析
        4.8.1 候選蛋白作抗原檢測候選蛋白免疫的小鼠的ELISA抗體水平
        4.8.2 MHP菌體蛋白作抗原檢測候選蛋白免疫小鼠的ELISA抗體水平
        4.8.3 MHP全菌蛋白作抗原Western Blot檢測候選蛋白免疫鼠血清
第五章 討論與結(jié)論
    5.1 討論
        5.1.1 候選蛋白的選擇
        5.1.2 候選蛋白的原核表達
        5.1.3 菌落原位免疫印跡初步篩選候選蛋白
        5.1.4 候選蛋白的純化
        5.1.5 候選蛋白的免疫特性分析
    5.2 結(jié)論
參考文獻
附錄1 PCR擴增引物
附錄2 SOE-PCR定點突變突變引物
附錄3 去N端跨膜區(qū)引物
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]豬支原體肺炎亞單位疫苗的免疫應答[J]. 馬豐英,姚睿玉,鄒浩勇,劉新軍,何啟蓋.  中國獸醫(yī)學報. 2012(04)
[2]豬肺炎支原體DnaK基因的表達及ELISA方法建立[J]. 劉茂軍,丁志勇,劉冬霞,杜海霞,繆芬芳,甘源,孔猛,馮志新,熊祺琰,白方方,杜改梅,邵國青.  金陵科技學院學報. 2011(04)
[3]表達豬肺炎支原體免疫原性基因的重組豬霍亂沙門氏菌對小鼠的免疫原性[J]. 馬豐英,鄒浩勇,何啟蓋.  微生物學報. 2011(09)
[4]豬肺炎支原體P36蛋白間接ELISA檢測方法的建立[J]. 祝永琴,馮志新,劉茂軍,吳敘蘇,邵國青.  江蘇農(nóng)業(yè)學報. 2010(05)
[5]豬肺炎支原體P46蛋白單克隆抗體制備[J]. 馮志新,遲靈芝,劉茂軍,王海燕,甘源,吳敘蘇,邵國青.  江蘇農(nóng)業(yè)學報. 2010(02)
[6]豬肺炎支原體p97 R1區(qū)基因和大腸桿菌LTB基因的重組和表達[J]. 盧會英,沈青春,寧宜寶.  中國獸醫(yī)雜志. 2010(04)
[7]豬肺炎支原體P52蛋白的原核表達及抗血清制備[J]. 曹培麗,李媛,陳超,郭丹,辛九慶,李繼昌.  中國預防獸醫(yī)學報. 2009(07)
[8]豬肺炎支原體中國分離株熱休克蛋白Hsp70（Dnak）的全基因克隆及C末端基因的表達與免疫活性分析[J]. 李媛,張建華,王亮,喬祖建,辛九慶.  中國預防獸醫(yī)學報. 2008(03)
[9]豬肺炎支原體乳酸脫氫酶基因的克隆、表達、純化及其間接ELISA檢測方法的建立[J]. 姚睿玉,何啟蓋,周銳,陳煥春.  中國獸醫(yī)學報. 2007(04)
[10]豬肺炎支原體的分子生物學研究進展[J]. 邵國青,蔡寶祥.  中國人獸共患病雜志. 1999(02)



本文編號：3317529