NS3蛋白是坦布蘇病毒（Duck Tembusu virus,TMUV）非結(jié)構(gòu)蛋白中的重要成員,其包含三個結(jié)構(gòu)域S7、DEXDc和HELICc,每個結(jié)構(gòu)域各自分別具有絲氨酸蛋白酶,核苷酸三磷酸酶和RNA解旋酶活性,其具有多種生物學功能,參與病毒生命周期調(diào)控和宿主內(nèi)抗病毒免疫反應(yīng)�；诮湍鸽p雜交系統(tǒng),在本研究中,先將構(gòu)建好的陽性重組質(zhì)粒pGBKT7-NS3轉(zhuǎn)化到酵母Y2H菌株中,證明它沒有自激活能力和毒性,表明誘餌酵母菌已經(jīng)準備完成,可以進行后續(xù)的篩選工作。將復蘇后的鴨胚成纖維細胞cDNA文庫的獵物酵母菌株與誘餌酵母菌株進行雜交混合培養(yǎng),得到誘餌與獵物質(zhì)粒共同存在的雜合二倍體酵母細胞。雜交后在營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上進行不同強度層次的篩選,先在低篩選強度的SD/-Trp/-Leu培養(yǎng)皿上進行篩選,以獲得較多無表型且生長狀態(tài)良好的酵母菌落,一對一進行轉(zhuǎn)板,用較高篩選強度的DDO/X/A培養(yǎng)皿篩選出藍色陽性克隆,再一對一轉(zhuǎn)板到QDO/X/A上進行高篩選力培養(yǎng),挑取陽性克隆接種到QDO/X/A重復篩選,以此得到更多、更為準確且重復性更高的陽性結(jié)果。與NCBI數(shù)據(jù)庫比對,提示篩選出了七種與NS3存在潛... 

【文章來源】：山東農(nóng)業(yè)大學山東省

【文章頁數(shù)】：86 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

TMUV基因組結(jié)構(gòu)圖

坦布蘇病毒 NS3 蛋白互作宿主蛋白的篩選、驗證反應(yīng)中的活躍程度（Gebhard et al., 2012）；其中，用伴隨其錨定到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，從而促進 NS3 解旋酶的解旋率（Shiryaev et al., 2009）。它同時又可以協(xié)NA 依賴性 RNA 聚合酶（RNA-dependent RNA p程中，它能夠協(xié)助分離瞬時形成的 dsRNA 中間體。三者的復合物，在 DENV 感染的宿主細胞內(nèi)能夠協(xié)W lk B et al., 2012）；也有相關(guān)研究顯示 NS3 蛋白，被歸為類似前凋亡蛋白，以觸發(fā)宿主細胞凋亡，

一種蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復合物，則在空間上重構(gòu)這兩個結(jié)構(gòu)域，由此可告基因的轉(zhuǎn)錄（Wang et al., 2018）。將重構(gòu)后的對應(yīng)載體分別轉(zhuǎn)化進系統(tǒng)中，如果誘餌和獵物相互作用，DNA-BD 結(jié)合域識別后并錨定，而此時與之互作的 pGal4 激活域能轉(zhuǎn)錄激活 UAS 啟動子所控制編基因。四種常用的報告基因是 AUR1-C、ADE2、HIS3 和 MEL1，他達，可以使酵母菌具備在營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基上仍能正常生長的特性。為篩選到的假陽性克隆，培養(yǎng)基中加入 X-α-Gal，可使 LacZ 表達之后顯行分辨和篩選（Walhout et al., 2001）。雙雜交技術(shù)近年來已被廣泛應(yīng)用于蛋白研究領(lǐng)域，漸漸成為發(fā)現(xiàn)和研和蛋白質(zhì)之間相互作用的基礎(chǔ)平臺。酵母雙雜交系統(tǒng)建立在真核生物白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，即使是蛋白質(zhì)之間短暫存在的微弱瞬時效應(yīng)因產(chǎn)物被敏感地檢測到，該技術(shù)原理簡單，應(yīng)用廣泛，這將為相關(guān)研面上的支持（Hamdi et al., 2012）。

【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
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[8]坦布蘇病毒對櫻桃谷育成鴨的致病性研究[D]. 路云建.山東農(nóng)業(yè)大學 2016
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本文編號：3316282