豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）嚴(yán)重危害世界養(yǎng)豬業(yè),目前仍無(wú)有效防控策略,因此探究宿主內(nèi)源性蛋白拮抗PRRSV的分子機(jī)理意義重大。前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)核因子I/A（nuclear factor I/A,NFIA）可以有效抑制PRRSV復(fù)制,故本試驗(yàn)以非洲綠猴胚胎腎細(xì)胞Marc-145細(xì)胞為模型,對(duì)NFIA抑制PRRSV復(fù)制的分子機(jī)理進(jìn)行了深入探究。首先,構(gòu)建NFIA的N末端DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域缺失質(zhì)粒pcDNA3.1-Flag-ΔN和C末端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域缺失質(zhì)粒pcDNA3.1-Flag-ΔC并分別轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞,24 h后感染PRRSV,48 h后用qRT-PCR和Western blot的試驗(yàn)方法分別檢測(cè)病毒N蛋白的RNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示ΔC仍能有效降低PRRSV的RNA水平和N蛋白水平,但ΔN則不再能降低PRRSV的RNA水平和N蛋白水平,這表明NFIA的N末端結(jié)構(gòu)域是抑制病毒的關(guān)鍵。其次,對(duì)NFIA全長(zhǎng)質(zhì)粒pcDNA3.1-Flag-WT進(jìn)行N末端結(jié)構(gòu)域內(nèi)不同功能位... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2020,40(06)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

缺失C末端結(jié)構(gòu)域(ΔC)的NFIA仍能抑制PRRSV的RNA和蛋白表達(dá)

查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)NFI蛋白的N末端結(jié)構(gòu)域具有二聚化、DNA結(jié)合以及促進(jìn)腺病毒復(fù)制等多項(xiàng)重要功能,而針對(duì)該結(jié)構(gòu)域的幾個(gè)重要功能位點(diǎn)進(jìn)行2個(gè)連續(xù)氨基酸的定點(diǎn)突變可以分別破壞其功能[14]。由此,針對(duì)NFIA的N末端結(jié)構(gòu)域內(nèi)幾個(gè)不同功能位點(diǎn)分別在pcDNA3.1-Flag-WT質(zhì)粒上進(jìn)行雙堿基突變,依次破壞掉野生型NFIA基因的促腺病毒復(fù)制功能(Mut1,YR86～87WL)、DNA結(jié)合功能(Mut2,LR119～120VD)和二聚化功能(Mut3,LF135～136VD)(圖5)。通過在線引物設(shè)計(jì)工具NEBaseChangerTM設(shè)計(jì)3對(duì)背靠背引物并由生工合成,利用Q5定點(diǎn)突變?cè)噭┖蟹謩e構(gòu)建定點(diǎn)突變質(zhì)粒pcDNA3.1-Flag-Mut1、pcDNA3.1-Flag-Mut2和pcDNA3.1-Flag-Mut3,測(cè)序驗(yàn)證無(wú)誤后去內(nèi)毒素提取質(zhì)粒。分別按照200,400,800 ng/孔的濃度轉(zhuǎn)染Mut1到Marc-145細(xì)胞進(jìn)行濃度梯度過表達(dá),另外轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1-Flag作為陰性對(duì)照,轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Flag-WT作為陽(yáng)性對(duì)照,24 h后感染PRRSV(MOI=1),48 h后收獲細(xì)胞,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白免疫印記試驗(yàn)分別檢測(cè)病毒ORF7 mRNA及N蛋白表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)相比空載體,Mut1仍能下調(diào)PRRSV的RNA和蛋白表達(dá)水平,并存在劑量依賴(圖6)。

為確認(rèn)NFIA在Marc-145細(xì)胞中對(duì)PRRSV復(fù)制的影響,分別進(jìn)行了濃度梯度的NFIA過表達(dá)和抑制表達(dá)試驗(yàn):分別按照200,400,800 ng/孔的濃度轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Flag-WT到Marc-145細(xì)胞,并轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1-Flag作為對(duì)照,24 h后感染PRRSV(MOI=1),48 h后收獲細(xì)胞,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白免疫印記試驗(yàn)分別檢測(cè)病毒ORF7 mRNA及N蛋白表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)NFIA能顯著抑制PRRSV的RNA和蛋白表達(dá),并且存在劑量依賴(圖1)。分別按照10,20,40 nmol/L的濃度轉(zhuǎn)染si-NFIA到Marc-145細(xì)胞,并轉(zhuǎn)染非特異性siRNA作陰性對(duì)照(negative control,NC),24 h后感染PRRSV(MOI=1),48 h后收獲細(xì)胞,分別檢測(cè)病毒ORF7 mRNA及N蛋白表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)抑制NFIA表達(dá)會(huì)提高PRRSV的RNA和蛋白表達(dá)量,且存在劑量依賴(圖2)。圖2 抑制NFIA表達(dá)能增強(qiáng)PRRSV的RNA和蛋白表達(dá)


本文編號(hào)：3308213