豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）嚴重危害世界養(yǎng)豬業(yè),目前仍無有效防控策略,因此探究宿主內(nèi)源性蛋白拮抗PRRSV的分子機理意義重大。前期試驗發(fā)現(xiàn)核因子I/A（nuclear factor I/A,NFIA）可以有效抑制PRRSV復(fù)制,故本試驗以非洲綠猴胚胎腎細胞Marc-145細胞為模型,對NFIA抑制PRRSV復(fù)制的分子機理進行了深入探究。首先,構(gòu)建NFIA的N末端DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域缺失質(zhì)粒pcDNA3.1-Flag-ΔN和C末端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域缺失質(zhì)粒pcDNA3.1-Flag-ΔC并分別轉(zhuǎn)染Marc-145細胞,24 h后感染PRRSV,48 h后用qRT-PCR和Western blot的試驗方法分別檢測病毒N蛋白的RNA和蛋白表達水平。結(jié)果顯示ΔC仍能有效降低PRRSV的RNA水平和N蛋白水平,但ΔN則不再能降低PRRSV的RNA水平和N蛋白水平,這表明NFIA的N末端結(jié)構(gòu)域是抑制病毒的關(guān)鍵。其次,對NFIA全長質(zhì)粒pcDNA3.1-Flag-WT進行N末端結(jié)構(gòu)域內(nèi)不同功能位... 

【文章來源】：中國獸醫(yī)學(xué)報. 2020,40(06)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：9 頁

【部分圖文】：

缺失C末端結(jié)構(gòu)域(ΔC)的NFIA仍能抑制PRRSV的RNA和蛋白表達

查閱文獻發(fā)現(xiàn)NFI蛋白的N末端結(jié)構(gòu)域具有二聚化、DNA結(jié)合以及促進腺病毒復(fù)制等多項重要功能,而針對該結(jié)構(gòu)域的幾個重要功能位點進行2個連續(xù)氨基酸的定點突變可以分別破壞其功能[14]。由此,針對NFIA的N末端結(jié)構(gòu)域內(nèi)幾個不同功能位點分別在pcDNA3.1-Flag-WT質(zhì)粒上進行雙堿基突變,依次破壞掉野生型NFIA基因的促腺病毒復(fù)制功能(Mut1,YR86～87WL)、DNA結(jié)合功能(Mut2,LR119～120VD)和二聚化功能(Mut3,LF135～136VD)(圖5)。通過在線引物設(shè)計工具NEBaseChangerTM設(shè)計3對背靠背引物并由生工合成,利用Q5定點突變試劑盒分別構(gòu)建定點突變質(zhì)粒pcDNA3.1-Flag-Mut1、pcDNA3.1-Flag-Mut2和pcDNA3.1-Flag-Mut3,測序驗證無誤后去內(nèi)毒素提取質(zhì)粒。分別按照200,400,800 ng/孔的濃度轉(zhuǎn)染Mut1到Marc-145細胞進行濃度梯度過表達,另外轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1-Flag作為陰性對照,轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Flag-WT作為陽性對照,24 h后感染PRRSV(MOI=1),48 h后收獲細胞,通過實時熒光定量PCR和蛋白免疫印記試驗分別檢測病毒ORF7 mRNA及N蛋白表達水平,發(fā)現(xiàn)相比空載體,Mut1仍能下調(diào)PRRSV的RNA和蛋白表達水平,并存在劑量依賴(圖6)。

為確認NFIA在Marc-145細胞中對PRRSV復(fù)制的影響,分別進行了濃度梯度的NFIA過表達和抑制表達試驗:分別按照200,400,800 ng/孔的濃度轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Flag-WT到Marc-145細胞,并轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1-Flag作為對照,24 h后感染PRRSV(MOI=1),48 h后收獲細胞,通過實時熒光定量PCR和蛋白免疫印記試驗分別檢測病毒ORF7 mRNA及N蛋白表達水平,發(fā)現(xiàn)過表達NFIA能顯著抑制PRRSV的RNA和蛋白表達,并且存在劑量依賴(圖1)。分別按照10,20,40 nmol/L的濃度轉(zhuǎn)染si-NFIA到Marc-145細胞,并轉(zhuǎn)染非特異性siRNA作陰性對照(negative control,NC),24 h后感染PRRSV(MOI=1),48 h后收獲細胞,分別檢測病毒ORF7 mRNA及N蛋白表達水平,發(fā)現(xiàn)抑制NFIA表達會提高PRRSV的RNA和蛋白表達量,且存在劑量依賴(圖2)。圖2 抑制NFIA表達能增強PRRSV的RNA和蛋白表達


本文編號：3308213