豬,是我們獲取動物蛋白質(zhì)的主要來源。豬肉品質(zhì)好壞直接影響著口感。隨著生活水平的提高,人們對豬肉品質(zhì)的要求也有所提高。因此,通過分子育種的方法改善豬的肉質(zhì)性狀是當前比較熱門的一項研究課題。為此,我們在分子水平上對豬的脂肪相關(guān)基因APOA2和肌肉相關(guān)基因SEPW1進行了相關(guān)性研究,主要集中在基因的啟動子區(qū)域進行轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析。所得的結(jié)果如下所述：（1）豬APOA2和SEPW1基因在豬不同組織中表達情況的研究。主要采用實時定量PCR的方法進行檢測,并建立了組織表達譜。結(jié)果為：豬APOA2基因主要在肝臟中表達,并且表達量很高；在脂肪中也有微量的表達;在其它組織中表達量極低,可忽略不計。豬SEPW1基因在各個組織中均有不同程度的表達,而在心臟和腓腸肌組織中表達量最高,在脾臟中表達量最低。（2）豬APOA2和SEPW1基因5’側(cè)翼調(diào)控序列的克隆。我們參照NCBI上提供的基因5’側(cè)翼調(diào)控序列進行引物設(shè)計,以豬基因組DNA為模板,克隆了豬APOA2基因1919bp和SEPW1基因1993bp的序列。序列克隆結(jié)果與NCBI上提供的序列進行比對,相似度均達到99%。（3）豬SEPW1基因啟動子CpG島甲基化... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
常用中英文縮略詞表
第一章 文獻綜述
    1 前言
    2 真核生物啟動子的研究進展
        2.1 真核生物啟動子的結(jié)構(gòu)
        2.2 真核生物啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控
    3 啟動子的預(yù)測和研究方法
        3.1 啟動子的預(yù)測技術(shù)
        3.2 啟動子的研究方法
    4 DNA甲基化的研究
        4.1 DNA甲基化的作用
        4.2 DNA甲基化的檢測方法
    5 APOA2基因的研究進展
    6 SEPW1基因的研究進展
    7 研究的目的和意義
第二章 實驗材料和方法
    1 試驗材料
        1.1 主要的生化試劑和藥品
        1.2 細胞、菌株和載體及豬基因組DNA
        1.3 試劑盒
        1.4 主要的儀器、設(shè)備及耗材
        1.5 緩沖液和常用試劑的配制
        1.6 組織表達譜分析的樣品
        1.7 DNA甲基化分析的樣品
        1.8 主要的生物學軟件和網(wǎng)站
    2 試驗方法
        2.1 豬不同組織總RNA的提取及cDNA的合成
            2.1.1 利用TRIzol試劑同時從豬的不同組織中提取RNA,具體步驟如下
            2.1.2 cDNA的合成
            2.1.3 豬APOA2和SEPW1基因的組織表達譜
        2.2 豬APOA2和SEPW1基因5’側(cè)翼序列的克隆和分析
            2.2.1 基因5’側(cè)翼調(diào)控序列的擴增
            2.2.2 擴增產(chǎn)物的檢測及回收
            2.2.3 pMD-18T載體的連接
            2.2.4 感受態(tài)的制備和連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
            2.2.5 陽性克隆的篩選及測序
            2.2.6 小量提取含目的片段的pMD18-T載體的質(zhì)粒
        2.3 豬APOA2和SEPW1基因近端啟動子缺失分析
            2.3.1 豬APOA2和SEPW1基因近端啟動子生物信息學分析
            2.3.2 基因5’側(cè)翼調(diào)控序列缺失載體的構(gòu)建
            2.3.3 轉(zhuǎn)染細胞并進行雙熒光素酶報告基因檢測
            2.3.4 進一步缺失分析尋找轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點
            2.3.5 定點突變試驗
            2.3.6 轉(zhuǎn)錄因子超表達試驗
            2.3.7 轉(zhuǎn)錄因子SP1的siRNA干擾試驗
        2.4 啟動子區(qū)域的甲基化研究
            2.4.1 豬組織DNA的提取
            2.4.2 DNA亞硫酸氫鹽處理
            2.4.3 PCR擴增、克隆及測序
第三章 實驗結(jié)果與分析
    1 豬APOA2基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析
        1.1 豬APOA2基因組織表達譜分析
        1.2 豬APOA2基因5’側(cè)翼調(diào)控序列的克隆和分析
        1.3 豬APA02基因5’側(cè)翼調(diào)控序列的生物信息學分析
        1.4 豬APOA2基因5’側(cè)翼調(diào)控序列的缺失載體的構(gòu)建
        1.5 豬APOA2基因啟動子缺失重組表達載體的活性分析
        1.6 進一步缺失分析以尋求轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點
        1.7 點突變的驗證試驗
    2 豬SEPW1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析
        2.1 豬SEPW1基因組織表達譜分析
        2.2 豬SEPW1基因5側(cè)翼調(diào)控序列的克隆和分析
        2.3 豬SEPW1基因5'側(cè)翼調(diào)控序列的生物信息學分析
        2.4 豬SEPW1基因5'側(cè)翼調(diào)控序列缺失載體的構(gòu)建
        2.5 豬SEPW1基因啟動子缺失重組表達載體的活性分析
        2.6 進一步缺失分析以尋找轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點
        2.7 點突變的驗證試驗
        2.8 超表達驗證試驗
        2.9 siRNA干擾試驗
            2.9.1 實時熒光定量PCR檢測干擾的效果
            2.9.2 熒光活性檢測
        2.10 豬SEPW1基因啟動子區(qū)域CpG島甲基化分析
            2.10.1 豬SEPW1基因部分區(qū)域CpG島預(yù)測
            2.10.2 包含CpG島的片段擴增
            2.10.3 CpG島甲基化的情況分析
            2.10.4 甲基化與基因表達量的相關(guān)分析
            2.10.5 肌肉組織在不同時期和不同豬種中的甲基化情況分析
第四章 討論
    1 豬APOA2基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分析討論
        1.1 豬APOA2基因的組織表達情況分析討論
        1.2 豬APOA2基因啟動子分析討論
        1.3 關(guān)于轉(zhuǎn)錄因子GATA1的分析討論
    2 豬SEPW1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分析討論
        2.1 豬SEPW1基因的組織表達情況分析討論
        2.2 豬SEPW1基因啟動子分析討論
        2.3 關(guān)于轉(zhuǎn)錄因子SP1的分析討論
第五章 小結(jié)
    1 本研究的主要結(jié)果
    2 下一步的工作計劃
參考文獻
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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[5]真核生物啟動子的預(yù)測技術(shù)[J]. 孫吉貴,韓霄松,盧欣華,行榮,仲洋.  計算機科學. 2009(01)
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[7]RNAi技術(shù)綜述[J]. 吳錦銀.  現(xiàn)代醫(yī)院. 2006(12)
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本文編號：3299158