乳腺分泌上皮細(xì)胞是乳腺中唯一能夠合成、分泌乳汁的細(xì)胞，體外培養(yǎng)的具有分泌功能的乳腺分泌上皮細(xì)胞是研究乳腺泌乳功能的重要工具。本研究通過活體采集嶗山奶山羊乳腺組織，利用組織塊貼壁法獲得原代乳腺上皮細(xì)胞，純化后通過顯微操作法對乳腺上皮細(xì)胞進行單克隆培養(yǎng)，并通過形態(tài)觀察、生長曲線繪制、廣譜角蛋白和波形蛋白免疫熒光染色、相關(guān)基因的RT-PCR等方法對單克隆細(xì)胞系進行鑒定，以獲得徹底純化的奶山羊乳腺分泌上皮細(xì)胞系。以嶗山奶山羊不同泌乳時期乳腺組織miRNA高通量測序數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，分析miR-200c與ACACA基因的靶向關(guān)系。以嶗山奶山羊單克隆乳腺分泌上皮細(xì)胞為試驗材料，通過載體構(gòu)建和細(xì)胞轉(zhuǎn)染，利用qRT-PCR、雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)及Western-blot等方法驗證miR-200c與ACACA基因的靶向關(guān)系。主要研究結(jié)果如下：（1）采用組織塊培養(yǎng)法分離得到了嶗山奶山羊原代乳腺上皮細(xì)胞，初步純化后，利用顯微操作法，獲得并擴繁了乳腺分泌上皮細(xì)胞的單克隆培養(yǎng)體系；（2）單細(xì)胞克隆培養(yǎng)獲得的奶山羊乳腺分泌上皮細(xì)胞，形態(tài)整齊、生長旺盛，具有典型的上皮細(xì)胞形態(tài)特征和‘S’型細(xì)胞生長曲線，廣譜角蛋白和波形... 

【文章來源】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省

【文章頁數(shù)】：76 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

乳腺上皮細(xì)胞系譜（Hennighausenetal.，2005）

研究人員對乳腺細(xì)胞的增殖分化以及凋亡進行了詳細(xì)。乳腺上皮的增殖、分化和衰退伴隨著成年動物生殖和泌乳發(fā)育階段受上皮和間質(zhì)的相互作用以及全身和局部的類固d et al.，2012），也受到自然環(huán)境因素的影響。育始于胚胎期，至出生時已經(jīng)基本成型。青春期前，乳腺和春期時，乳腺的導(dǎo)管系統(tǒng)才開始顯著生長。此時末端乳芽漸侵入脂肪墊，產(chǎn)生復(fù)雜的導(dǎo)管系統(tǒng)，直至充滿整個脂肪產(chǎn)生的雌激素和孕酮促進并加速了導(dǎo)管系統(tǒng)的發(fā)育。性成初級和次級導(dǎo)管，伴隨著發(fā)情周期的變化，導(dǎo)管也經(jīng)歷周期素環(huán)境的改變刺激了細(xì)胞的增殖和腺泡的形成，并于妊娠泌乳期，腺泡完全成熟，腔上皮細(xì)胞開始合成并分泌乳汁體在經(jīng)歷凋亡和重塑后逐漸恢復(fù)到妊娠前的狀態(tài)。以上發(fā)

3.1 乳腺分泌上皮細(xì)胞系的建立3.1.1 原代乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)3.1.1.1 原代乳腺上皮細(xì)胞的分離組織塊培養(yǎng)法獲得原代乳腺上皮細(xì)胞的時間長短不一，從接種至第一次傳代的周約為 10 天。乳腺組織小塊接種 24 h 后進行第一次觀察，發(fā)現(xiàn)組織塊周圍出現(xiàn)暈圈，有顆粒狀物質(zhì)游出（圖 3-1A）；4 d 后，組織塊周圍游離出少量細(xì)胞，多為成纖維樣胞（圖 3-1B），同時也可見少量上皮樣細(xì)胞（圖 3-1C）；8 d 后大部分組織塊周圍長出量的細(xì)胞，排列緊密，形態(tài)近似圓形，且多為上皮樣細(xì)胞（圖 3-1D）。繼續(xù)培養(yǎng)，待胞匯合率為 90%左右時除去組織塊并消化、傳代。

【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
[1]嶗山奶山羊ACACA和SCD基因多態(tài)性與泌乳性狀的關(guān)聯(lián)分析[D]. 王金鳳.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2011



本文編號：3295847