喹噁啉類藥物是一類人工合成的、含有喹嗯啉-1,4-二氧化物基本結(jié)構(gòu)的一類化學(xué)合成抗菌藥物,在提高飼料轉(zhuǎn)化率、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)方面具有相當(dāng)好的活性。隨著該類藥物的廣泛使用,卡巴氧和喹乙醇已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)有明顯的致癌、致畸、致突變、光敏和腎上腺皮質(zhì)損傷等副作用。腎上腺是該類化合物主要的毒性靶器官之一,該類中大多數(shù)藥物對(duì)腎上腺皮質(zhì)產(chǎn)生損害,引起球狀帶分泌的醛固酮減少,造成動(dòng)物機(jī)體內(nèi)水鹽代謝紊亂。為了闡述喹噁啉類藥物對(duì)腎上腺產(chǎn)生毒性,及其下調(diào)醛固酮激素分泌水平,造成水鹽代謝紊亂的機(jī)制,本課題以人腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞NCI-H295R細(xì)胞系為細(xì)胞模型,應(yīng)用基因芯片,并采用蛋白質(zhì)組學(xué)中經(jīng)典的雙向電泳和質(zhì)譜分析相結(jié)合的技術(shù)為手段展開研究。本研究首先測(cè)定了喹嗯啉類藥物喹烯酮和乙酰甲喹孵育H295R細(xì)胞12、24及36h時(shí)的細(xì)胞活力,結(jié)果顯示,兩種藥物對(duì)H295R細(xì)胞的毒性均呈現(xiàn)出劑量依賴性和時(shí)間依賴性趨勢(shì),并且初步確定喹烯酮的細(xì)胞毒性大于乙酰甲喹的。然后在保證細(xì)胞活力的基礎(chǔ)上,調(diào)整藥物濃度,采用醛固酮ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)藥物對(duì)H295R細(xì)胞分泌醛固酮激素的影響,結(jié)果顯示,喹烯酮下調(diào)醛固酮激素分泌的能力也強(qiáng)于乙酰... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：132 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語表
1 前言
    1.1 喹噁啉類藥物概況
    1.2 喹噁啉類藥物對(duì)腎上腺皮質(zhì)毒性研究概況
        1.2.1 醛固酮的生物合成和調(diào)控過程
        1.2.2 喹噁啉類藥物抑制醛固酮合成及分泌的機(jī)制研究
    1.3 研究目標(biāo)和內(nèi)容
2 材料方法
    2.1 細(xì)胞株
    2.2 主要試劑
    2.3 主要儀器
    2.4 主要試劑的配制
    2.5 細(xì)胞培養(yǎng)及凍存
    2.6 細(xì)胞活力測(cè)定
    2.7 醛固酮激素分泌水平檢測(cè)
    2.8 NCI-H295R細(xì)胞基因表達(dá)譜檢測(cè)
        2.8.1 樣品的RNA抽提
        2.8.2 RNA純化及質(zhì)控
        2.8.3 樣品標(biāo)記
        2.8.4 標(biāo)記擴(kuò)增后的cRNA并質(zhì)檢
        2.8.5 芯片雜交
        2.8.6 芯片洗脫
        2.8.7 芯片掃描
        2.8.8 數(shù)據(jù)分析
    2.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證基因芯片中差異基因的mRNA表達(dá)
        2.9.1 細(xì)胞總RNA提取
        2.9.2 cDNA合成
        2.9.3 實(shí)時(shí)熒光定量Real-time PCR
        2.9.4 熒光定量數(shù)據(jù)分析
        2.9.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    2.10 Western Blot方法驗(yàn)證Keap1的蛋白表達(dá)情況
        2.10.1 細(xì)胞處理及分組
        2.10.2 細(xì)胞蛋白提取及濃度測(cè)定
        2.10.3 SDS-PAGE凝膠電泳
        2.10.4 轉(zhuǎn)膜
        2.10.5 封閉
        2.10.6 一抗孵育
        2.10.7 二抗孵育
        2.10.8 化學(xué)發(fā)光顯色
    2.11 雙向電泳技術(shù)檢測(cè)H295R細(xì)胞差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究
        2.11.1 細(xì)胞處理及分組
        2.11.2 細(xì)胞總蛋白的制備
        2.11.3 蛋白質(zhì)定量
        2.11.4 蛋白質(zhì)水化上樣
        2.11.5 一相等點(diǎn)聚焦(IEF)
        2.11.6 IPG膠條平衡
        2.11.7 二相SDS-PAGE電泳
        2.11.8 固定
        2.11.9 染色
        2.11.10 圖像掃描及分析
    2.12 蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定
        2.12.1 膠內(nèi)酶解
        2.12.2 MALDI-TOF質(zhì)譜分析及數(shù)據(jù)庫搜索
    2.13 Western Blot方法驗(yàn)證NME1和TCP1蛋白表達(dá)情況
3 結(jié)果
    3.1 喹烯酮和乙酰甲喹對(duì)H295R細(xì)胞劑量及時(shí)間依賴性毒性作用
    3.2 喹烯酮和乙酰甲喹對(duì)H295R細(xì)胞分泌醛固酮激素的影響
    3.3 H295R細(xì)胞基因表達(dá)譜檢測(cè)
        3.3.1 總RNA質(zhì)量的鑒定
        3.3.2 總RNA完整性的鑒定
        3.3.3 芯片質(zhì)量與可靠性分析
        3.3.4 差異基因數(shù)量分析
        3.3.5 差異基因的分類
    3.4 基因芯片結(jié)果中部分差異基因的mRNA表達(dá)水平的驗(yàn)證
        3.4.1 RNA質(zhì)量的鑒定
        3.4.2 部分差異基因的熔解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線的圖示
        3.4.3 部分差異基因的mRNA水平檢測(cè)
        3.4.4 部分差異基因經(jīng)qRT-PCR驗(yàn)證及芯片數(shù)據(jù)的比較結(jié)果
    3.5 喹烯酮對(duì)Keap1和Nrf2蛋白表達(dá)的影響
    3.6 雙向電泳分離喹烯酮作NCI-H295R系細(xì)胞的總蛋白
        3.6.1 考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合顯色法測(cè)定蛋白質(zhì)含量
        3.6.2 喹烯酮處理與未處理NCI-H295R細(xì)胞雙向電泳圖譜的建立
        3.6.3 差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定結(jié)果
        3.6.4 利用STRING數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用結(jié)果
        3.6.5 Western blot技術(shù)驗(yàn)證雙向電泳和質(zhì)譜鑒定結(jié)果
4 討論
    4.1 基因芯片采取的藥物作用濃度和作用時(shí)間的選擇依據(jù)
    4.2 喹烯酮處理H295R細(xì)胞的靶基因功能分析
        4.2.1 物質(zhì)合成代謝相關(guān)基因
        4.2.2 膽固醇生物合成相關(guān)基因
        4.2.3 醛固酮合成通路相關(guān)基因
        4.2.4 調(diào)控醛固酮生物合成的相關(guān)基因
        4.2.5 氧化應(yīng)激相關(guān)基因
    4.3 喹烯酮處理H295R細(xì)胞的差異蛋白功能分析
    4.4 基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果之間的關(guān)系
    4.5 喹烯酮影響H295R細(xì)胞分泌醛固酮激素的分子機(jī)制
5 全文總結(jié)
6 文獻(xiàn)綜述：藥物對(duì)腎上腺鹽皮質(zhì)激素影響研究進(jìn)展
    6.1 醛固酮的作用機(jī)制研究
    6.2 醛固酮的生物合成和調(diào)控
        6.2.1 醛固酮的生物合成過程
        6.2.2 調(diào)控醛固酮合成的主要因素
    6.3 醛固酮的分泌和調(diào)控因素
        6.3.1 醛固酮的分泌
        6.3.2 調(diào)控醛固酮分泌的主要因素
    6.4 藥物對(duì)腎上腺鹽皮質(zhì)激素的影響研究現(xiàn)狀
        6.4.1 與腎素-血管緊張素系統(tǒng)相關(guān)
        6.4.2 與Ca/CaM/CaMK通路相關(guān)
        6.4.3 類固醇激素合成酶抑制劑
        6.4.4 醛固酮拮抗劑
        6.4.5 其他
    6.5 展望
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)介
附錄


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]鹽皮質(zhì)激素的非基因組作用及其機(jī)制[J]. 周海洋,肖林,陳宜張.  生理科學(xué)進(jìn)展. 2008(01)
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碩士論文
[1]喹噁啉類對(duì)腎上腺皮質(zhì)醛固酮合成酶表達(dá)調(diào)控的影響[D]. 楊春輝.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2012



本文編號(hào)：3295081