豬細(xì)小病毒4型（Porcine parvovirus 4, PPV4）是近年來新發(fā)現(xiàn)的流行病原,其主要引起豬的呼吸道和繁殖障礙性疾病。目前關(guān)于PPV4的研究主要限于流行病學(xué)和病理學(xué)方面,還沒有合適的體外細(xì)胞系統(tǒng)用于PPV4的增殖。鑒于此,本研究以桿狀病毒為載體,構(gòu)建了表達PPV4的主要結(jié)構(gòu)基因ORF2的重組桿狀病毒,并對其免疫原性進行了研究。具體內(nèi)容如下：1.PPV4 P基因的原核表達及純化通過對PPV4 VP的抗原決定簇進行分析,將其截短為304-500aa,通過BamhⅠ和HindⅢ雙酶切后克隆入pET-28a原核表達載體獲得重組質(zhì)粒pET-28a-VP,經(jīng)誘導(dǎo)表達后對蛋白進行復(fù)性純化。以純化蛋白包被ELISA酶標(biāo)板,通過方陣滴定確定其最佳包被濃度,為后期小鼠動物試驗免疫效果評價提供檢測方法。2.表達]PPV4的VP和VP2基因的一拷貝的重組桿狀病毒的構(gòu)建及其免疫原性研究通過BamHI 和 HindⅢ將PPV4的VP2和VP分別克隆入pFastBac載體,獲得重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFBD-VP2 和 BD-VP。將其轉(zhuǎn)化于DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞,藍白斑篩選純化后提取桿粒,轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞獲... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：66 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
英文縮略表(Abbreviations)
1 文獻綜述
    1.1 病毒由來
        1.1.1 博卡病毒的由來
        1.1.2 博卡病毒的發(fā)現(xiàn)
    1.2 病原基本特征
    1.3 流行病學(xué)
        1.3.1 分布特點
        1.3.2 博卡病毒的年齡分布及流行季節(jié)
        1.3.3 分子流行病學(xué)
    1.4 博卡病毒的致病性與致病機理
        1.4.1 博卡病毒的致病性
        1.4.2 博卡病毒的致病機理
    1.5 桿狀病毒研究進展
        1.5.1 桿狀病毒的發(fā)展
    1.6 桿狀病毒表達系統(tǒng)的研究
        1.6.1 Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)概述
        1.6.2 Bac-to-Bac表達系統(tǒng)在疫苗研究中的應(yīng)用
        1.6.3 桿狀病毒表達系統(tǒng)表達外源蛋白的研究
2 研究目的與意義
3 材料與方法
    3.1 實驗材料
        3.1.1 菌種、細(xì)胞及毒株
        3.1.2 載體與質(zhì)粒
        3.1.3 工具酶及主要試劑
        3.1.4 主要培養(yǎng)基的配制
        3.1.5 主要緩沖液
        3.1.6 本研究所用PCR引物
        3.1.7 試驗動物及試驗地點
    3.2 實驗方法
        3.2.1 限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)
        3.2.2 PCR或酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測
        3.2.3 PCR或酶切產(chǎn)物的回收與純化
        3.2.4 外源DNA片段與載體的連接反應(yīng)
        3.2.5 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備(氯化鈣法)
        3.2.6 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
        3.2.7 重組質(zhì)粒的小量制備(OMEGA質(zhì)粒小提試劑盒)
        3.2.8 重組質(zhì)粒的大量制備(OMEGA質(zhì)粒大提試劑盒)
        3.2.9 目的蛋白的原核誘導(dǎo)表達
        3.2.10 包涵體提取、純化與復(fù)性
        3.2.11 構(gòu)建重組桿狀病毒的操作流程
        3.2.12 重組穿梭載體(Bacmid)的構(gòu)建
        3.2.13 重組穿梭載體(Bacmid)的提取
        3.2.14 重組桿狀病毒的獲得
        3.2.15 間接免疫熒光試驗(IFA)檢測目的蛋白的表達
        3.2.16 Western blot檢測目的蛋白的表達
        3.2.17 病毒粒子的電鏡觀察
        3.2.18 動物試驗
        3.2.19 實時熒光定量PCR檢測免疫小鼠脾細(xì)胞中IFN-α、IFN-β、IFN-γ相對表達水平
        3.2.20 統(tǒng)計學(xué)方法
4 結(jié)果與分析
    4.1 PPV4的ORF2基因的截短表達及純化
        4.1.1 pET28a-VP原核表達載體的構(gòu)建
        4.1.2 VP截短蛋白的原核表達
        4.1.3 VP截短蛋白包涵體的復(fù)性
        4.1.4 間接ELISA確定截短蛋白VP的最佳包被濃度
    4.2 表達PPV4的ORF2的桿狀病毒的構(gòu)建及免疫效力的初步評價
        4.2.1 表達PPV4的單拷貝VP2、VP桿狀病毒的構(gòu)建及鑒定
        4.2.2. 表達PPV4的多拷貝VP2、VP桿狀病毒的構(gòu)建
        4.2.3 表達PPV4的ORF2的桿狀病毒的動物試驗
            4.2.3.1 重組桿狀病毒免疫小鼠抗PPV4的ELISA抗體檢測
            4.2.3.2 實時熒光定量PCR檢測免疫小鼠脾細(xì)胞中細(xì)胞因子mRNA表達
5 討論
    5.1 PPV4.VP蛋白的原核表達及純化
    5.2 表達PPV4的ORF2基因的重組桿狀病毒的構(gòu)建及其免疫原性研究
        5.2.1 轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建及蛋白表達
        5.2.2 病毒樣顆粒VLPs的觀察
        5.2.3 重組桿狀病毒動物免疫效果的初步評估
6 結(jié)論
參考文獻
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號：3286622