CRISPR/Cas9系統(tǒng)是第三代基因編輯技術(shù),由Cas9蛋白和識(shí)別靶位點(diǎn)的導(dǎo)向RNA（guide RNA,gRNA）組成,因其靶向編輯靶基因的特異性、高效性和設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)便性等諸多優(yōu)點(diǎn),得到更為廣泛的應(yīng)用。肌肉生長(zhǎng)抑制素（myostatin,MSTN）負(fù)向調(diào)控骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育,該基因缺失會(huì)導(dǎo)致“雙肌”性狀,提高產(chǎn)肉性能;黑素皮質(zhì)素受體1基因（melanocortin 1 receptor,MC1R）、酪氨酸酶基因（tymsinase,TYR）是動(dòng)物黑色素合成過程中的主要調(diào)控基因。本研究中,根據(jù)CRISPR/Cas9設(shè)計(jì)原理,針對(duì)MSTN、MC1R和TYR基因選擇了4個(gè)靶位點(diǎn)（MT1、MT2、MC1和TY1）,構(gòu)建了相應(yīng)的打靶載體和報(bào)告載體,并在HEK293T細(xì)胞中驗(yàn)證了核酸酶活性。最終實(shí)現(xiàn)了雞DF-1細(xì)胞系和雞原代成纖維細(xì)胞的靶向基因編輯,進(jìn)一步開展雞胚注射CRISPR/Cas9生產(chǎn)基因修飾雞技術(shù)方法的探索與優(yōu)化。主要結(jié)果如下:1.通過CRISPR Design在線軟件篩選了MSTN、MC1R和TYR三個(gè)基因的4個(gè)靶位點(diǎn),采用重疊PCR方法構(gòu)建打靶載體,利用引物直接退火方式構(gòu)建報(bào)告載體。將... 

【文章來(lái)源】：陜西理工大學(xué)陜西省

【文章頁(yè)數(shù)】：78 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

鋅指核酸酶識(shí)別靶序列的示意圖

1.1.1.2 TALEN 技術(shù)TALEN 是使用類轉(zhuǎn)錄激活因子（Transcription activator-like effector, TALE）代替 Z作為 DNA 結(jié)合域，與 Fok I 切割結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成核酸酶。TALE 是植物病原體黃單胞菌（Xanthomonas）表達(dá)[12]。TALEN 由 N 端分泌信號(hào)結(jié)構(gòu)域、C 端核定位結(jié)構(gòu)域和 TAL重復(fù)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成（圖 1-2）。不同的 TALE 的 DNA 結(jié)合域由數(shù)目不同的、高度保守的重復(fù)單元串聯(lián)而成，每個(gè)重復(fù)單元有 33~35 個(gè)氨基酸殘基，僅第 12 和 13 位氨基酸是高度可變的，被稱為重復(fù)序列可變的雙氨基酸殘基（repeat variable diresidues, RVDs）。一個(gè) RVD 能夠識(shí)別一個(gè)堿基[13]，將多個(gè)重復(fù)序列串聯(lián)起來(lái)就能夠識(shí)別不同的 DNA 序列同 ZFN 相比，存在于 TALEN 中 Fok I 核酸酶同樣需要二聚化才能對(duì) DNA 進(jìn)行切割，所以在構(gòu)建過程中，需要在目標(biāo) DNA 中選擇一定間隔的序列，TALEN 識(shí)別并結(jié)合該序列，F(xiàn)ok I 才有活性。

越多的這種間隔的重復(fù)序列被發(fā)現(xiàn)，在細(xì)菌和古生菌中存在廣泛。2002 年，Mojica[20]與 Jansen[21]等將這種重復(fù)序列命名為串聯(lián)間隔短回文重復(fù)序列（Clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats, CRISPR），同時(shí)根據(jù) Cas 基因序列及蛋白結(jié)構(gòu)可以將 CRISPR/Cas9 存在 3 種類型（I 型、II 型和 III 型），但不了解其功能。直到 2005 年，研究發(fā)現(xiàn)重復(fù)序列與外源的質(zhì)粒和噬菌體高度相似，推測(cè)可能與細(xì)菌本身的免疫系統(tǒng)有關(guān)[22-24]。Barrangou 等[25]在 2007 年研究嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）Ⅱ型CRISPR/Cas 系統(tǒng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，間隔序列能夠識(shí)別外 DNA，而 Cas 蛋白能夠獲得外源間隔序列和降解噬菌體。2008 年，在大腸桿菌中，Cas 蛋白被成熟的 crRNAs 引導(dǎo)形成復(fù)合體，病毒增殖受到抑制，CRISPR/Cas 被證明具有免疫能力[26]。2012 年，Ⅱ型 CRISPR/Cas系統(tǒng)在目的 DNA 特定位點(diǎn)產(chǎn)生 DNA 雙鏈缺口（double stranded breaks，DSB）為Ⅱ型CRISPR/Cas 系統(tǒng)在基因組定點(diǎn)編輯的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)[27]。隨后，3 個(gè)不同類型的CRISPR/Cas 系統(tǒng)的具體免疫機(jī)制陸續(xù)被揭示出來(lái)[28-31]。


本文編號(hào)：3280826