誘導多能干細胞（Induced Pluripotent stem Cell,iPSC）具有分化成多種類型細胞的潛能。其中iPSC在體外誘導分化成生殖細胞對于畜禽保種育種、轉基因動物以及發(fā)育生物學研究具有重要的意義。Dazl是調(diào)控生殖細胞發(fā)育與分化的關鍵因子,是生殖細胞鑒定的主要標志物。由于Dazl在iPSC不表達,因此可以作為報告基因追蹤iPSC誘導分化為生殖細胞的過程。本研究利用 CRISPR/Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）技術介導的同源末端連接（Homology-Mediated End Joining,HMEJ）將紅色熒光蛋白基因mCherry定點敲入雞內(nèi)源Dazl基因第10個內(nèi)含子處,通過Dazl啟動子驅動mCherry表達,從而精確追蹤內(nèi)源Dazl在iPSC分化為原始生殖細胞（Primordial germ cell,PGC）的過程中的表達情況。具體研究結果如下:（1）DAZL在雞PGC和iPSC細胞中的表達鑒定。我們首先克隆雞Dazl基因,制備DAZL多克隆抗體。純... 

【文章來源】：廣西大學廣西壯族自治區(qū) 211工程院校

【文章頁數(shù)】：92 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

及生Z家族蛋白同源性分析扭engarajet欲2010)

為制作雞ＤＡＺＬ多克隆抗體，本試驗首先克隆雞Ｄｍ／基因的編碼區(qū)（Ｃｏｄｉｎｇ??ｓｅｑｕｅｎｃｅ，?ＣＤＳ），ＰＣＲ擴增得到８７０?ｂｐ片段（圖１－１?），純化回收后將它連接到ｐＥＴ－Ｂ２Ｍ??線性載體上，經(jīng)測序克隆片段在第６８１?ｂｐ和７５３?ｂｐ產(chǎn)生無義突變（圖１－２）。利用構??建好的ｐＥＴ－Ｂ２Ｍ－Ｄｍ／載體轉化大腸桿菌，成功地誘導表達ＤＡＺＬ蛋白于上清，純化??上清液中的蛋白，結果如圖所示，重組蛋白分子量約為４７?ＫＤａ，純度為８５％（圖１－３）。??然后，將純化好的蛋白免疫日本大耳兔。在日本大耳兔經(jīng)過４次抗原免疫之后，抽取??其血清樣本檢測免疫效價。結果顯示，經(jīng)過免疫反應的兔血清效價超過１：?５１２０００?（圖??１－４），符合抗體制備要求。而后，取經(jīng)抗原免疫過的兔抗血清進行純化，重組抗體分??子量為４７?ＫＤａ左右，抗體濃度為１０?ｍｇ／ｍｌ，純度為９５％?（圖１－５），與預期結果一致。??為驗證制備的抗體具有特異性和靈敏性，我們利用純化的ＤＡＺＬ多克隆抗體進行免??疫印跡

ｍｍ－Ｍ?Ｎ?Ｎ?Ｎ?Ｎ?＼ｖ?ｖ??圖１－４兔抗血清效價圖??Ｆｉｇ．?１?－４?Ａｎｔｉｓｅｒｕｍ?Ｖａｌｕｅ?Ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?Ｒａｂｂｉｔ??２５??


本文編號：3279325