為了制備安全且有效的氣腫疽新型疫苗,控制氣腫疽的暴發(fā),本研究建立了氣腫疽的原核表達(dá)載體,制備了氣腫疽融合基因亞單位疫苗和單基因亞單位疫苗,并對(duì)兩種疫苗的免疫水平進(jìn)行了評(píng)價(jià)。本研究根據(jù)已報(bào)道的氣腫疽梭菌的fliA和nanA基因設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物,以氣腫疽梭菌基因組DNA為模板,擴(kuò)增出兩段大小分別為429bp的fliA基因片段和1113bp的nanA片段。利用SOE-PCR串聯(lián)兩個(gè)片段,在引物中加入了柔性Linker,得到大小約為1587bp的融合基因,并將該融合基因和鞭毛基因分別與pMD18-T Simple載體連接,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)DH5α中,獲得克隆載體fliA和pMD18-fliA-nanA。繼而對(duì)克隆載體進(jìn)行雙酶切,獲得帶有黏性末端的fliA片段和fliA-nanA片段,與具有相同黏性末端的PEGX-4T-1原核表達(dá)載體進(jìn)行連接,將連接后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)BL21中,從而構(gòu)建出了重組質(zhì)粒pEGX-4T-fliA-nanA和pEGX-4T-fliA原核表達(dá)載體。對(duì)重組質(zhì)粒PEGX-4T-fliA-nanA和pEGX-4T-fliA進(jìn)行雙酶切鑒定、PCR鑒定、及序列測(cè)定后... 

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【文章頁(yè)數(shù)】：52 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
目錄
前言
    1.1 氣腫疽簡(jiǎn)介及研究進(jìn)展
        1.1.1 氣腫疽梭菌特性
        1.1.2 流行病學(xué)
        1.1.3 臨床癥狀
        1.1.4 診斷
        1.1.5 氣腫疽的預(yù)防
    1.2 氣腫疽梭菌鞭毛蛋白簡(jiǎn)介
    1.3 氣腫疽梭菌神經(jīng)氨酸酶簡(jiǎn)介
    1.4 氣腫疽疫苗研究進(jìn)展
    1.5 本研究的目的及意義
材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 菌株
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2.1.3 二抗與制備血清用試劑
        2.1.4 載體及主要試劑
        2.1.5 試驗(yàn)所需溶液
        2.1.6 主要儀器及設(shè)備
    2.2 方法
        2.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成
        2.2.2 氣腫疽梭菌的培養(yǎng)
        2.2.3 菌體核酸DNA提取
        2.2.4 nanA基因與fliA基因的PCR擴(kuò)增與拼接
        2.2.5 PCR產(chǎn)物的純化
        2.2.6 目的基因與T載體連接
        2.2.7 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
        2.2.8 重組質(zhì)粒的提取
        2.2.9 重組質(zhì)粒的鑒定
        2.2.10 質(zhì)粒的純化回收
        2.2.11 目的片段與pGEX-4T-1載體連接、轉(zhuǎn)化和篩選
        2.2.12 原核表達(dá)載體的鑒定
        2.2.13 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)
        2.2.14 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳
        2.2.15 表達(dá)產(chǎn)物的免疫印跡分析
        2.2.16 重組蛋白的大量表達(dá)
        2.2.17 融合蛋白的純化
        2.2.18 接種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2.2.19 免疫動(dòng)物血清分離
        2.2.20 間接ELISA檢測(cè)抗體水平
        2.2.21 細(xì)胞因子的檢測(cè)
結(jié)果
    3.1 氣腫疽梭菌的革蘭氏染色
    3.2 氣腫疽梭菌的血液瓊脂平板菌落
    3.3 目的基因的擴(kuò)增
    3.4 重組質(zhì)粒的PCR鑒定
    3.5 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定
    3.6 重組質(zhì)粒的序列測(cè)定
    3.7 重組表達(dá)載體的PCR鑒定
    3.8 重組表達(dá)載體的酶切鑒定
    3.9 表達(dá)蛋白SDS-PAGE電泳圖
    3.10 蛋白免疫印跡分析
    3.11 蛋白存在形式鑒定
    3.12 純化蛋白鑒定
    3.13 體液免疫水平檢測(cè)
    3.14 細(xì)胞免疫水平檢測(cè)
討論
結(jié)論
謝辭
作者簡(jiǎn)介
參考文獻(xiàn)


【參考文獻(xiàn)】：
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碩士論文
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本文編號(hào)：3260212