目前研究表明,瘋草類有毒植物的毒性成分-苦馬豆素（Swainsonine）主要由三類真菌產生,即豆類絲核菌（Rhizocronia leguminicola）、金龜子綠僵菌（Metarhizium anisopliae）和棘豆蠕孢菌（Alternaria oxytropis）,而有關苦馬豆素生物合成通路及催化酶基因尚不清楚。鑒于此,本試驗以金龜子綠僵菌為研究對象,通過PEG介導的方法對金龜子綠僵菌合成苦馬豆素疑似催化酶基因SwnR進行敲除并驗證其功能,旨在探討SwnR基因在金龜子綠僵菌苦馬豆素生物合成通路中的作用,為深入研究苦馬豆素生物合成通路及相關催化酶基因奠定理論基礎。試驗結果如下:1.根據(jù)GeneBank上的標準序列設計SwnR基因引物,以金龜子綠僵菌cDNA為模板,高保真擴增SwnR基因,PCR產物測序結果與SwnR基因序列BLAST比對同源性為99%。2.以pUC19載體為骨架,通過無縫克隆的方法構建含有苯菌靈抗性基因的金龜子綠僵菌SwnR基因的敲除載體,SwnR上游基因序列和下游基因序列分別連在苯菌靈抗性基因的兩端。經PCR和測序鑒定,成功構建載體。3.選用不同發(fā)酵時間的金... 

【文章來源】：西北農林科技大學陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：68 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻綜述
    1.1 金龜子綠僵菌研究進展
        1.1.1 金龜子綠僵菌生物特征
        1.1.2 金龜子綠僵菌生長條件
    1.2 苦馬豆素研究概況
        1.2.1 苦馬豆素理化性質
        1.2.2 苦馬豆素毒性機制
        1.2.3 苦馬豆素藥理學作用
        1.2.4 苦馬豆素臨床應用
        1.2.5 苦馬豆素化學合成
        1.2.6 苦馬豆素植物來源
        1.2.7 苦馬豆素微生物來源
        1.2.8 苦馬豆素生物合成通路
    1.3 真菌遺傳轉化研究進展
        1.3.1 真菌遺傳轉化的方法
        1.3.2 PEG介導的真菌遺傳轉化
        1.3.3 篩選標記
第二章 金龜子綠僵菌SwnR基因的敲除
    2.1 試驗材料
        2.1.1 質粒和菌種
        2.1.2 試劑
        2.1.3 培養(yǎng)基與溶液
        2.1.4 儀器
    2.2 金龜子綠僵菌SwnR基因敲除載體的構建
        2.2.1 金龜子綠僵菌基因組DNA的提取—CTAB法
        2.2.2 金龜子綠僵菌SwnR基因的獲得與測序
        2.2.3 質粒pBAR的制備
    2.3 金龜子綠僵菌SwnR基因的敲除和鑒定
        2.3.1 金龜子綠僵菌藥敏試驗
        2.3.2 金龜子綠僵菌原生質體的制備與轉化
        2.3.3 SwnR敲除突變菌株的篩選和鑒定
    2.4 試驗結果
        2.4.1 SwnR基因及進化樹的構建
        2.4.2 SwnR基因敲除盒的構建
        2.4.3 苯菌靈和草銨膦敏感濃度篩選
        2.4.4 原生質體制備最佳條件篩選
        2.4.5 SwnR基因突變菌株的獲得
    2.5 討論
第三章 金龜子綠僵菌SwnR基因突變菌株功能驗證
    3.1 試驗材料
        3.1.1 材料
        3.1.2 試劑
        3.1.3 儀器
    3.2 金龜子綠僵菌SwnR基因缺失菌株功能驗證
        3.2.1 金龜子綠僵菌野生型和突變型菌株生長速度測定
        3.2.2 金龜子綠僵菌野生型和突變型菌株發(fā)酵培養(yǎng)
        3.2.3 金龜子綠僵菌野生型和突變型菌株發(fā)酵產物分析前準備
        3.2.4 金龜子綠僵菌野生型和突變型菌株發(fā)酵液中苦馬豆素含量的高分辨質譜儀檢測
        3.2.5 金龜子綠僵菌SwnR基因突變菌株苦馬豆素生物合成通路關鍵基因表達檢測
    3.3 試驗結果
        3.3.1 金龜子綠僵菌野生型和突變型菌株的表型觀察結果
        3.3.2 金龜子綠僵菌野生型和突變型菌株發(fā)酵液中苦馬豆素含量的高分辨質譜儀檢測結果
        3.3.3 SwnR基因缺失菌株中苦馬豆素生物合成通路關鍵基因表達檢測結果
    3.4 討論
第四章 結論
附錄A
附錄B
參考文獻
致謝
個人簡歷


【參考文獻】：
期刊論文
[1]真菌中環(huán)二肽及其衍生物的抗腫瘤活性研究進展[J]. 強薇,梅剛.  中國藥房. 2014(21)
[2]苦馬豆素人工抗原接種和田羊的免疫學研究[J]. 王帥,胡建軍,陳根元,賈琦珍,馬春暉,張玲.  黑龍江畜牧獸醫(yī). 2014(05)
[3]苦馬豆素誘導新生SD大鼠大腦皮質神經細胞凋亡[J]. 張樑,趙寶玉,路浩,王姍姍,溫偉利,周啟武,王文龍.  中國獸醫(yī)學報. 2014(02)
[4]不同溫濕度條件下綠僵菌LA菌株對東亞飛蝗的致病力[J]. 朱彬洲,雷仲仁,徐洪富,王兆勇,梁興慧.  中國生物防治. 2010(04)
[5]保定蝗區(qū)土壤綠僵菌對飛蝗高毒力菌株的篩選[J]. 田甜,李瑞軍,陸秀君,張龍,董建臻,張振波,張怡.  植物保護. 2009(05)
[6]苦馬豆素抗腫瘤作用研究進展[J]. 路浩,王建軍,孫莉莎,趙寶玉,王占新,馬堯,陳基萍,劉忠艷.  動物醫(yī)學進展. 2009(09)
[7]金龜子綠僵菌中苦馬豆素的提取[J]. 李錫杰,楊鳴琦,張偉,郭衛(wèi)華,戴卉敏.  精細化工. 2009(06)
[8]生防綠僵菌研究進展[J]. 金玉榮,殷宏,羅建勛.  安徽農業(yè)科學. 2009(05)
[9]苦馬豆素的抑瘤和免疫增強作用[J]. 劉巍,張曉彬,李雅,楊甫昭,謝人明.  西北藥學雜志. 2006(06)
[10]金龜子綠僵菌發(fā)酵代謝產物中苦馬豆素的初步研究[J]. 路宏朝,楊鳴琦,朱曉飛,何欣,李衛(wèi)彬.  西北農業(yè)學報. 2006(04)

碩士論文
[1]金龜子綠僵菌中苦馬豆素的提取及其對新城疫疫苗免疫效果的影響[D]. 吳延磊.西北農林科技大學 2011



本文編號：3257623