肺炎克雷伯氏菌是一種條件致病菌，過去人們認為對畜禽危害不大，一直未引起重視。但是近年來關(guān)于肺炎克雷伯氏菌引起毛皮動物疾病的報道卻在迅速增加，加之各種抗菌藥物的廣泛使用，導(dǎo)致該菌的耐藥性增強，多重耐藥菌株的出現(xiàn)，肺炎克雷伯氏菌病在毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)中危害越來越嚴重，因此隨著環(huán)境的改變，肺炎克雷伯氏菌作為人畜共患傳染病的病原，應(yīng)引起廣泛的重視。本研究對肺炎克雷伯氏菌在傳統(tǒng)的理化特性鑒定基礎(chǔ)上，又對12株不同動物來源的代表性菌株進行了23S rRNA基因序列的分析、構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，比較各菌種屬間的差異，為肺炎克雷伯氏菌在分子水平的系統(tǒng)學(xué)研究和遺傳多樣性研究奠定基礎(chǔ)，建立了一種快速、簡便的肺炎克雷伯氏菌的鑒定方法和23S rRNA基因序列分析方法。由于目前市場上尚沒有有效的肺炎克雷伯氏菌疫苗用于該病的防治，致使該病得不到合理有效的防治，嚴重制約著毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展。因此本研究分別以泰山松花粉多糖、蜂膠等為佐劑，利用微膠囊技術(shù)制備了肺炎克雷伯氏菌微膠囊疫苗，并口服免疫小白鼠，檢測免疫指標(biāo)，對于肺炎克雷伯氏菌的防治具有重要意義，同時為新型口服疫苗和控釋制劑的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。1.山東部分地區(qū)毛皮動物肺... 

【文章來源】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省

【文章頁數(shù)】：81 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

SrRNA可變區(qū)位點結(jié)構(gòu)

該分離菌在血液平板上均呈圓形、隆起、濕潤、閃光、邊緣整齊、灰白色、不透明、易融合、黏稠、接種環(huán)挑起易拉成長絲、生長豐盛的奶油狀菌落，其在血液平板上有β型溶血暈。8株分離菌革蘭氏染色為陰性，粗短桿菌（圖2），單個、成對或個別短鏈狀排列，無鞭毛、有莢膜，菌體大小約為0.3-1.5 μm×0.6-6.0 μm。圖2 分離菌株菌落形態(tài)及鏡檢結(jié)果Fig.2 Colony characteristics and morphology after Gram stainingA：分離菌株菌落形態(tài)；B：分離菌株鏡檢結(jié)果A: Colony characteristics of the bacteria isolates; B: morphology after Gram staining the bacteria isolates3.1.3 生化鑒定結(jié)果將不同地區(qū)分離率最高的8株有代表性的疑似肺炎克雷伯氏菌分別通過細菌生化試驗（微量發(fā)酵管）和ATB Expression半自動細菌鑒定儀進行鑒定，8株分離菌的生化特性一致，生化試驗結(jié)果見表3。表3 分離菌株的生化鑒定結(jié)果Table3 Physiological and biochemical characteristics of the bacteria isolates生化項目Detection結(jié)果Result生化項目Detection結(jié)果Result生化項目Detection結(jié)果Result生化項目Detection結(jié)果Result生化項目Detection結(jié)果Result山梨糖 + 肌醇 + 密二糖 + 枸櫞酸鹽 + 葡萄糖 +棉子糖 + 山梨醇 + 丙二酸鹽 + 硫化氫 - 血清菊糖 -蔗糖 + 側(cè)金盞花醇 + 賴氨酸 + 尿素 + 鼠李糖 +麥芽糖 + 甘露醇 + 纖維二糖 + 七葉苷 + 阿拉伯糖 +木糖 + 衛(wèi)矛醇 - 硝酸鹽還原 + 0/F 發(fā)酵 + MR -乳糖 + 氰化鉀 + β-半乳糖 + ONPG + VP +注:“+”為陽性反應(yīng),“-”為陰性反應(yīng)Note: “+”stands for positive; “-”stands for negative

33圖3 小鼠剖檢病變結(jié)果Fig.3 Necropsy lesions of mouseA：肝臟出血點；B：肝臟壞死A: Haemorrhage nod of liver; B: Necrosis of liver3.1.6 16S rRNA 基因序列與系統(tǒng)發(fā)育分析提取以上8株分離菌的基因組，對其16S rRNA擴增,在423 bp處有目的片段，與預(yù)期擴增結(jié)果一致（圖4）。將8株分離菌株所測序列與GenBank收錄的肺炎克雷伯氏菌菌株通過DNAStar進行同源性分析，并繪制成系統(tǒng)進化樹（圖5）。8株分離菌株核苷酸序列之間同源性為99.1%-99.8%，與AY9963633株肺炎克雷伯氏菌（中國河北）核苷酸序列同源性為99.3%-100%，與AB675600株肺炎克雷伯氏菌（日本）核苷酸序列同源性為98.6%-99.1%（圖6），結(jié)果顯示本研究分離的8株分離菌與國內(nèi)菌株同源性更近。圖4 8株分離菌16S rRNA目的基因的PCR結(jié)果Fig

【參考文獻】：
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博士論文
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本文編號：3250537