為研究牛胚胎氣管細(xì)胞的TOLL樣受體2（TLR2）和TOLL樣受體9（TLR9）在牛皰疹病毒Ⅰ型（BHV-1）感染的天然免疫反應(yīng)中的作用,本研究利用小分子干擾RNA（siRNA）技術(shù),以TLR2和TLR9為靶向分別設(shè)計(jì)并合成3條siRNA干擾序列,用SYBR Green Ⅰ定量PCR技術(shù)篩選出最佳的siRNA-TLR2和siRNA-TLR9干擾序列,繼而轉(zhuǎn)染EBTr細(xì)胞使其沉默TLR2和TLR9后感染BHV-1,分析對(duì)BHV-1增殖規(guī)律及細(xì)胞因子IL-6、TNF-α和IFN-β表達(dá)的影響。結(jié)果顯示,在 EBTr 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染 siRNA-TLR2A、siRNA-2B 和 siRNA-TLR2C 48h后對(duì)TLR2 mRNA表達(dá)量下調(diào)了 35.05%、69.20%和84.85%,篩選出的siTLR2C片段在12⁷2 h可以顯著抑制TLR2 mRNA表達(dá)（p<0.05）,用該片段轉(zhuǎn)染EBTr細(xì)胞再感染BHV-1后6⁷2 h,siRNA-TLR2組BHV-1 DNA拷貝數(shù)顯著低于對(duì)照組（p<0.05）,在EBTr細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNA-TL... 

【文章來源】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū)

【文章頁數(shù)】：72 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖１?ＲＮＡｉ的作用機(jī)制［６８］??Ｆｉｇ．?１?ｍｅｃｈａｎｉｓｍ?ｏｆ?ＲＮＡｉ?ａｃｔｉｏｎ??

１５??對(duì)一個(gè)視野中所有細(xì)胞貼壁細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后在同一視野中轉(zhuǎn)換至激發(fā)??波長(zhǎng)為５６５?ｎｍ的熒光濾鏡下對(duì)發(fā)紅色熒光的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)（圖３）。當(dāng)轉(zhuǎn)??染試劑的體積為７．５?ＭＬ／孔，干擾片段的量為２５?ｐｍｏｌ／孔時(shí)轉(zhuǎn)染效率就達(dá)到??了較好的轉(zhuǎn)染效果。??ａ?－??＿??■??圖３?脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染陽性樣品后的ＥＢＴｒ細(xì)胞（Ｘ?２００）??Ｆｉｇ．３?Ｍｉｃｒｏｇｒａｐｈｓ?ｏｆ?Ｐｏｓｉｔｉｖｅ?ｓａｍｐｌｅｓ?ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ?ＥＢＴｒ?ｃｃｌｊｓ?（?＞?２００?）??注：Ａ．脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染陽性樣品至ＥＢＴｒ細(xì)胞２４?ｈ后的〇光顯微鏡照片；Ｂ．脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染陽性樣??品至ＥＢＴｒ細(xì)胞２４?ｈ后的熒光顯微镋照片；Ｃ．對(duì)照組轉(zhuǎn)染ＥＢＴｒ細(xì)胞２４?ｈ的白光顯微鏡照片；??Ｄ．對(duì)照組轉(zhuǎn)染ＥＢＴｒ細(xì)胞２４?ｈ的熒光顯微鏡照片。??Ａ．?ＥＢＴｒ?ｃｅｌｌｓ?ｗｅｒｅ?ｏｂｓｅｒｖｅｄ?ｕｎｄｅｒ?ｗｈｉｔｅ?ｌｉｇｈｔ?ａｆｔｅｒ?ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ?ｔｈｅ?Ｐｏｓｉｔｉｖｅ?ｓａｍｐｌｅｓ?２４?ｈ?ｂｙ??ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ?：?Ｂ．?ＥＢＴｒ?ｃｅｌｌｓ?ｗｅｒｅ?ｏｂｓｅｒｖｅｄ?ｕｎｄｅｒ?ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ?ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ?ａｆｔｅｒ?ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ?ｔｈｅ??Ｐｏｓｉｔｉｖｅ?ｓａｍｐｌｅｓ?２４?ｈ?ｂｙ?ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ；Ｃ．?Ｔｈｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ?ｇｒｏｕｐ?ＥＢＴｒ?ｃｅｌｌｓ?ｗｅｒｅ?ｏｂｓｅｒｖｅｄ?ｕｎｄｅｒ

用標(biāo)準(zhǔn)品分別繪制各自的擴(kuò)增曲線圖、標(biāo)準(zhǔn)曲線圖和溶解曲線圖，各??稀釋梯度的標(biāo)準(zhǔn)品生成的擴(kuò)増曲線的Ｃｔ值都接近等差出現(xiàn)于基準(zhǔn)線上，表??示出了良好的線性關(guān)系（圖４、圖７、圖１０），ＴＬＲ２、（３－ａｃｔｉｎ和ＴＬＲ９的標(biāo)??準(zhǔn)曲線斜率分別為－３．４６５、－３．５６０和－３．３９０，擴(kuò)增效率分別為９４．３４２％、??９０．９４１?％和９７．２２０％?，相關(guān)系數(shù)都是Ｒ２＝?０．９９９?（圖５、圖８、圖１１），溶??解曲線均出現(xiàn)單一峰，表明引物具有很好的特異性，（圖６、圖９、圖１２）。??４．２５０．０Ｃ３?：??－？，０００．０００?ｉ??３．７５ａ？〇ｊ??３．５３ａ．〇ｃ〇ｉ?ｚ．’’?，，??３＾０．〇０〇ｉ??．?丨?？?／?—么???３．０９０．０００＾?／：一－一一；，??２，７５０．０００－｝?／?／??ｃ?２．５００．Ｋ３０）?．’?／?／?／??＜?２＾５０．００５１?／?／?／?／??２＾ｏｍ＼?Ｉ?／?／?／??ｊ?／?／?／??？Ｓ？?．?．．?．?１?．?／?！?ｔ?；??？?？一－?—?－?■?￣?７?；?■?ｊ?ｊ?ｆ??／?／?／?／??１．ＣＯＣ．ＯＳＯ?ｊ?／?／?／?／??７５０

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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[2]IBRV對(duì)牛單核巨噬細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子的影響[D]. 陳玉惠.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 2013
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本文編號(hào)：3236279