自Mattioli等于1988年首次對豬卵母細(xì)胞體外成熟（IVM）研究以來,在許多研究人員的努力下,雖然豬卵母細(xì)胞IVM體系得到了較大的改進(jìn)和優(yōu)化,但是IVM效果依然較差。影響卵母細(xì)胞IVM效果的因素有許多,如：IVM基礎(chǔ)培養(yǎng)液的成分；IVM培養(yǎng)液中的添加成分：激素及其濃度、細(xì)胞因子、卵泡液、抗氧化物質(zhì)及維生素等；采取卵子的卵泡直徑大小；卵母細(xì)胞周圍包裹卵丘細(xì)胞的有無及數(shù)量多少；成熟培養(yǎng)時的溫度、氣相條件以及成熟培養(yǎng)時間等等。IVM過程中卵母細(xì)胞的核質(zhì)成熟往往不同步,這也是導(dǎo)致IVM效果較差的關(guān)鍵因素之一。為了有效推動豬卵母細(xì)胞核質(zhì)同步成熟,提高豬卵母細(xì)胞IVM效率,本研究在IVM中首次對顆粒細(xì)胞（GCs） FSH受體的過表達(dá)展開設(shè)計(jì),采用帶有新型熒光蛋白基因的慢病毒載體介導(dǎo)FSH受體基因轉(zhuǎn)染GCs,實(shí)現(xiàn)FSH受體在GCs膜上長期、穩(wěn)定的過表達(dá)。將卵母細(xì)胞與轉(zhuǎn)染后的GCs共培養(yǎng)進(jìn)行IVM,通過分析核質(zhì)成熟的進(jìn)程,闡明GCs膜上FSH受體過表達(dá)對豬卵母細(xì)胞核質(zhì)成熟的調(diào)節(jié)機(jī)制,并以此來提高豬卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)的成熟率。本試驗(yàn)具體從以下幾個方面進(jìn)行了研究：1.豬FSHR基因的克隆及慢病毒表達(dá)載... 

【文章來源】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：90 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
目錄
摘要
ABSTRACT
英文縮寫說明
第一章 豬卵母細(xì)胞IVM及FSHR的研究進(jìn)展
    1. 卵母細(xì)胞在體內(nèi)發(fā)生、發(fā)育簡介
        1.1 卵泡的發(fā)育和成熟
        1.2 卵子在體內(nèi)的發(fā)生和形態(tài)結(jié)構(gòu)
    2. 卵母細(xì)胞體外成熟(IVM)介紹
        2.1 卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)基礎(chǔ)培養(yǎng)液
        2.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加成分
        2.3 卵巢供體的動物種類年齡、所采集的卵泡大小及采集方式和采集的卵子質(zhì)量
        2.4 卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的條件
    3. 促卵泡素(FSH)和促黃體生成素(LH)對卵母細(xì)胞體外成熟發(fā)育的影響
    4. 促卵泡素受體(FSHR)基因及其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)簡介
    5. 慢病毒載體
第二章 豬FSHR克隆及慢病毒載體構(gòu)建
    1. 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 卵巢總RNA提取組織
        1.2 菌株和質(zhì)粒
        1.3 試驗(yàn)試劑及儀器
    2. 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 卵巢組織總RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄及FSHR基因的擴(kuò)增
        2.2 pMD19-T-FSHR載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化、克隆與鑒定
        2.3 將FSHR基因從pMD19-T-FSHR重組載體質(zhì)粒上酶切下來
        2.4 慢病毒重組載體CSⅡ-EF-FSHR-IRES2-Venus的構(gòu)建
    3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析
    4. 討論
第三章 豬卵泡顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)
    1. 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 卵巢組織
        1.2 主要試劑及配制
        1.3 主要試驗(yàn)儀器
    2. 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 豬原代卵泡顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)
        2.2 豬原代卵泡顆粒細(xì)胞傳代擴(kuò)大培養(yǎng)
        2.3 豬卵泡顆粒細(xì)胞的凍存
        2.4 豬卵泡顆粒細(xì)胞的解凍
    3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析
    4. 討論
        4.1 卵巢表面的消毒處理
        4.2 消化酶的選擇
        4.3 卵泡液內(nèi)紅細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的處理
        4.4 顆粒細(xì)胞的快速大量培養(yǎng)
第四章 慢病毒的包裝與感染力測定
    1. 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 質(zhì)粒
        1.2 主要試劑及配制
        1.3 主要試驗(yàn)儀器
    2. 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 三質(zhì)粒用無內(nèi)毒素大提試劑盒大量提取
        2.2 293T細(xì)胞的解凍與培養(yǎng)
        2.3 293T細(xì)胞的準(zhǔn)備、病毒的包裝與感染力觀察
    3. 結(jié)果及分析
    4. 討論
第五章 重組載體CSⅡ-EF-FSHR-IRES2-Venus電擊法轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞并與卵母細(xì)胞共IVM
    1. 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 豬卵巢組織
        1.2 主要試劑及配制
        1.3 主要試驗(yàn)儀器
    2. 試驗(yàn)方法
        2.1 用Lipofectamine~(TM)2000分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞和豬卵泡顆粒細(xì)胞
        2.2 電擊法將CSⅡ-EF-FSHR-IRES2-Venus轉(zhuǎn)染豬原代卵泡顆粒細(xì)胞
        2.3 CSⅡ-EF-FSHR-IRES2-Venus轉(zhuǎn)染的顆粒細(xì)胞與卵子共IVM
    3. 結(jié)果及分析
    4. 討論
        4.1 重構(gòu)慢病毒載體質(zhì)粒CSⅡ-EF-FSHR-IRES2-Venus轉(zhuǎn)染豬卵泡顆粒細(xì)胞
        4.2 豬卵母細(xì)胞IVM
        4.3 轉(zhuǎn)染CSⅡ-EF-FSHR-IRES2-Venus質(zhì)粒的顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞共培養(yǎng)
        4.4 顆粒細(xì)胞過表達(dá)FSHR對卵母細(xì)胞體外成熟影響的分析
全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號：3230973