MicroRNA-7-5p調(diào)控熱處理促進胰島素刺激的仔豬睪丸支持細胞乳酸分泌的分子機制
發(fā)布時間：2021-06-12 00:03
miRNA（MicroRNA）是一類內(nèi)源性短鏈非編碼小RNA,通過翻譯抑制或m RNA降解在轉錄后控制基因表達,參與細胞分化、增殖、凋亡及腫瘤發(fā)生等過程,在生物體內(nèi)的調(diào)控機制中發(fā)揮著重要的作用。睪丸支持細胞（Sertoli cells,SCs）除了為生精細胞提供結構支持,還能夠合成并分泌乳酸,為發(fā)育中的生精細胞提供營養(yǎng)底物,其乳酸合成過程常常受到胰島素等激素調(diào)控。前期研究發(fā)現(xiàn)溫和熱處理（以下簡稱熱處理）能夠提高胰島素受體底物2（IRS2）的表達,促進PI3K/Akt信號通路活化,以提高胰島素敏感性,但熱處理促進IRS2表達的分子機制尚未明確,miRNA是否介導熱處理后胰島素刺激的支持細胞乳酸生成還有待研究。本實驗首先通過TargetScan、miRWalk和MiRBase等軟件及數(shù)據(jù)庫預測與IRS2表達相關的miRNA,然后使用21日齡的仔豬睪丸支持細胞作為實驗材料,以43°C,30min對細胞進行熱處理,提取細胞總RNA,利用定量PCR技術篩選熱處理后表達發(fā)生變化的miRNA。根據(jù)篩選結果,人工合成miRNA mimic與miRNA inhibitor,并在Lipofectamine...
【文章來源】：西南大學重慶市 211工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數(shù)】：87 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
體外分離培養(yǎng)的支持細胞與其純度鑒定A.體外培養(yǎng)的支持細胞（100×）
西南大學碩士學位論文34MarkerControlHeattreat28s18s1.8~2.0之間，表明提取的RNA純度達到實驗的基本需求。濃度檢測顯示，對照組及熱處理組的RNA濃度均在300ng/μl~400ng/μl之間，滿足下一步實驗的需求。綜合說明提取的RNA樣品純度好、質(zhì)量高，可直接用后續(xù)實驗。圖4-2RNA完整性檢測Figure.4-2TheintegritydetectionoftotalRNA4.3熱處理對IRS2相關miRNA的影響通過TargetScan、miRWalk和MiRBase等軟件及數(shù)據(jù)庫預測靶向調(diào)控IRS2的miRNA，在此過程中發(fā)現(xiàn)在豬這個物種中靶向調(diào)控IRS2的miRNA數(shù)量非常少，最終篩選出7個可能的miRNAs，包括ssc-miR-96-5p、ssc-miR-142-3p、ssc-miR-7-5p、ssc-miR-142-5p、ssc-miR-133a-3p、ssc-miR-150和ssc-miR-155-5p。利用定量PCR檢測熱處理對上述7個miRNA表達的影響。圖4-3A展示了miRNAs和U6的擴增過程，擴增基線平滑，曲線呈標準的“S”型，表明擴增過程中幾乎沒有受到外界的干擾。同時各溶解曲線呈現(xiàn)平穩(wěn)的單峰，說明擴增引物特異性較好，擴增結果具有可信度（圖4-3B）。U6從10~20個循環(huán)開始起峰，達到作為內(nèi)參的基本要求。從圖4-3C可以看出，熱處理后僅ssc-miR-7-5p表達水平顯著下調(diào)，其余miRNA的表達水平均無明顯變化。與對照組相比，熱處理使細胞中ssc-miR-7-5p的水平降低了41.2%（P<0.01），表明ssc-miR-7-5p對熱處理的刺激非常敏感，接下來選定ssc-miR-7-5p作為后續(xù)研究對象。
第4章實驗結果37過質(zhì)量檢測的DNA為模板進行高保真PCR擴增，通過條帶數(shù)量和對應的片段大小判斷引物特異性。從4-4-1D可以發(fā)現(xiàn)，擴增產(chǎn)物為單一明亮的條帶，位置靠近200bp，預期目的片段位置一到處，說明設計的上下游引物特異性較好。圖4-4-1miRNA靶位點預測及DNA瓊脂糖凝膠電泳鑒定A.miR7-5p與IRS2靶位點預測B.種子序列在不同物種中的保守性C.DNA完整性鑒定D.IRS23’UTR片段擴增產(chǎn)物Fig4-4-1PredictionofmiRNAtargetsiteandidentificationofDNAagarosegelelectrophoresisA.PredictionforTargetSitesofmiR7-5pinIRS23’UTRB.ConservationofseedsequencesindifferentspeciesC.DNAintegrityidentificationD.AmplificationproductsofIRS23"UTRfragment4.4.2構建重組質(zhì)粒實驗中構建重組質(zhì)粒采用的載體為psiCHECK-2，包含有后續(xù)雙熒光素酶報告基因檢測實驗所需的基因結合位點：NotⅠ與XhoⅠ（4-4-2A）。將上一步高保真擴增后的DNA產(chǎn)物送樣檢測，合格后與psiCHECK-2載體按分子克隆方法進行酶
本文編號：3225531
【文章來源】：西南大學重慶市 211工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數(shù)】：87 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
體外分離培養(yǎng)的支持細胞與其純度鑒定A.體外培養(yǎng)的支持細胞（100×）
西南大學碩士學位論文34MarkerControlHeattreat28s18s1.8~2.0之間，表明提取的RNA純度達到實驗的基本需求。濃度檢測顯示，對照組及熱處理組的RNA濃度均在300ng/μl~400ng/μl之間，滿足下一步實驗的需求。綜合說明提取的RNA樣品純度好、質(zhì)量高，可直接用后續(xù)實驗。圖4-2RNA完整性檢測Figure.4-2TheintegritydetectionoftotalRNA4.3熱處理對IRS2相關miRNA的影響通過TargetScan、miRWalk和MiRBase等軟件及數(shù)據(jù)庫預測靶向調(diào)控IRS2的miRNA，在此過程中發(fā)現(xiàn)在豬這個物種中靶向調(diào)控IRS2的miRNA數(shù)量非常少，最終篩選出7個可能的miRNAs，包括ssc-miR-96-5p、ssc-miR-142-3p、ssc-miR-7-5p、ssc-miR-142-5p、ssc-miR-133a-3p、ssc-miR-150和ssc-miR-155-5p。利用定量PCR檢測熱處理對上述7個miRNA表達的影響。圖4-3A展示了miRNAs和U6的擴增過程，擴增基線平滑，曲線呈標準的“S”型，表明擴增過程中幾乎沒有受到外界的干擾。同時各溶解曲線呈現(xiàn)平穩(wěn)的單峰，說明擴增引物特異性較好，擴增結果具有可信度（圖4-3B）。U6從10~20個循環(huán)開始起峰，達到作為內(nèi)參的基本要求。從圖4-3C可以看出，熱處理后僅ssc-miR-7-5p表達水平顯著下調(diào)，其余miRNA的表達水平均無明顯變化。與對照組相比，熱處理使細胞中ssc-miR-7-5p的水平降低了41.2%（P<0.01），表明ssc-miR-7-5p對熱處理的刺激非常敏感，接下來選定ssc-miR-7-5p作為后續(xù)研究對象。
第4章實驗結果37過質(zhì)量檢測的DNA為模板進行高保真PCR擴增，通過條帶數(shù)量和對應的片段大小判斷引物特異性。從4-4-1D可以發(fā)現(xiàn)，擴增產(chǎn)物為單一明亮的條帶，位置靠近200bp，預期目的片段位置一到處，說明設計的上下游引物特異性較好。圖4-4-1miRNA靶位點預測及DNA瓊脂糖凝膠電泳鑒定A.miR7-5p與IRS2靶位點預測B.種子序列在不同物種中的保守性C.DNA完整性鑒定D.IRS23’UTR片段擴增產(chǎn)物Fig4-4-1PredictionofmiRNAtargetsiteandidentificationofDNAagarosegelelectrophoresisA.PredictionforTargetSitesofmiR7-5pinIRS23’UTRB.ConservationofseedsequencesindifferentspeciesC.DNAintegrityidentificationD.AmplificationproductsofIRS23"UTRfragment4.4.2構建重組質(zhì)粒實驗中構建重組質(zhì)粒采用的載體為psiCHECK-2，包含有后續(xù)雙熒光素酶報告基因檢測實驗所需的基因結合位點：NotⅠ與XhoⅠ（4-4-2A）。將上一步高保真擴增后的DNA產(chǎn)物送樣檢測，合格后與psiCHECK-2載體按分子克隆方法進行酶
本文編號：3225531
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