miRNA（MicroRNA）是一類內(nèi)源性短鏈非編碼小RNA,通過(guò)翻譯抑制或m RNA降解在轉(zhuǎn)錄后控制基因表達(dá),參與細(xì)胞分化、增殖、凋亡及腫瘤發(fā)生等過(guò)程,在生物體內(nèi)的調(diào)控機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用。睪丸支持細(xì)胞（Sertoli cells,SCs）除了為生精細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)支持,還能夠合成并分泌乳酸,為發(fā)育中的生精細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)底物,其乳酸合成過(guò)程常常受到胰島素等激素調(diào)控。前期研究發(fā)現(xiàn)溫和熱處理（以下簡(jiǎn)稱熱處理）能夠提高胰島素受體底物2（IRS2）的表達(dá),促進(jìn)PI3K/Akt信號(hào)通路活化,以提高胰島素敏感性,但熱處理促進(jìn)IRS2表達(dá)的分子機(jī)制尚未明確,miRNA是否介導(dǎo)熱處理后胰島素刺激的支持細(xì)胞乳酸生成還有待研究。本實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)TargetScan、miRWalk和MiRBase等軟件及數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)與IRS2表達(dá)相關(guān)的miRNA,然后使用21日齡的仔豬睪丸支持細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料,以43°C,30min對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熱處理,提取細(xì)胞總RNA,利用定量PCR技術(shù)篩選熱處理后表達(dá)發(fā)生變化的miRNA。根據(jù)篩選結(jié)果,人工合成miRNA mimic與miRNA inhibitor,并在Lipofectamine... 

【文章來(lái)源】：西南大學(xué)重慶市 211工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

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體外分離培養(yǎng)的支持細(xì)胞與其純度鑒定A.體外培養(yǎng)的支持細(xì)胞（100×）

西南大學(xué)碩士學(xué)位論文34MarkerControlHeattreat28s18s1.8~2.0之間，表明提取的RNA純度達(dá)到實(shí)驗(yàn)的基本需求。濃度檢測(cè)顯示，對(duì)照組及熱處理組的RNA濃度均在300ng/μl~400ng/μl之間，滿足下一步實(shí)驗(yàn)的需求。綜合說(shuō)明提取的RNA樣品純度好、質(zhì)量高，可直接用后續(xù)實(shí)驗(yàn)。圖4-2RNA完整性檢測(cè)Figure.4-2TheintegritydetectionoftotalRNA4.3熱處理對(duì)IRS2相關(guān)miRNA的影響通過(guò)TargetScan、miRWalk和MiRBase等軟件及數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)靶向調(diào)控IRS2的miRNA，在此過(guò)程中發(fā)現(xiàn)在豬這個(gè)物種中靶向調(diào)控IRS2的miRNA數(shù)量非常少，最終篩選出7個(gè)可能的miRNAs，包括ssc-miR-96-5p、ssc-miR-142-3p、ssc-miR-7-5p、ssc-miR-142-5p、ssc-miR-133a-3p、ssc-miR-150和ssc-miR-155-5p。利用定量PCR檢測(cè)熱處理對(duì)上述7個(gè)miRNA表達(dá)的影響。圖4-3A展示了miRNAs和U6的擴(kuò)增過(guò)程，擴(kuò)增基線平滑，曲線呈標(biāo)準(zhǔn)的“S”型，表明擴(kuò)增過(guò)程中幾乎沒有受到外界的干擾。同時(shí)各溶解曲線呈現(xiàn)平穩(wěn)的單峰，說(shuō)明擴(kuò)增引物特異性較好，擴(kuò)增結(jié)果具有可信度（圖4-3B）。U6從10~20個(gè)循環(huán)開始起峰，達(dá)到作為內(nèi)參的基本要求。從圖4-3C可以看出，熱處理后僅ssc-miR-7-5p表達(dá)水平顯著下調(diào)，其余miRNA的表達(dá)水平均無(wú)明顯變化。與對(duì)照組相比，熱處理使細(xì)胞中ssc-miR-7-5p的水平降低了41.2%（P<0.01），表明ssc-miR-7-5p對(duì)熱處理的刺激非常敏感，接下來(lái)選定ssc-miR-7-5p作為后續(xù)研究對(duì)象。

第4章實(shí)驗(yàn)結(jié)果37過(guò)質(zhì)量檢測(cè)的DNA為模板進(jìn)行高保真PCR擴(kuò)增，通過(guò)條帶數(shù)量和對(duì)應(yīng)的片段大小判斷引物特異性。從4-4-1D可以發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增產(chǎn)物為單一明亮的條帶，位置靠近200bp，預(yù)期目的片段位置一到處，說(shuō)明設(shè)計(jì)的上下游引物特異性較好。圖4-4-1miRNA靶位點(diǎn)預(yù)測(cè)及DNA瓊脂糖凝膠電泳鑒定A.miR7-5p與IRS2靶位點(diǎn)預(yù)測(cè)B.種子序列在不同物種中的保守性C.DNA完整性鑒定D.IRS23’UTR片段擴(kuò)增產(chǎn)物Fig4-4-1PredictionofmiRNAtargetsiteandidentificationofDNAagarosegelelectrophoresisA.PredictionforTargetSitesofmiR7-5pinIRS23’UTRB.ConservationofseedsequencesindifferentspeciesC.DNAintegrityidentificationD.AmplificationproductsofIRS23"UTRfragment4.4.2構(gòu)建重組質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建重組質(zhì)粒采用的載體為psiCHECK-2，包含有后續(xù)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)所需的基因結(jié)合位點(diǎn)：NotⅠ與XhoⅠ（4-4-2A）。將上一步高保真擴(kuò)增后的DNA產(chǎn)物送樣檢測(cè)，合格后與psiCHECK-2載體按分子克隆方法進(jìn)行酶


本文編號(hào)：3225531