2001年chen等人發(fā)現(xiàn)了一種新的A型流感病毒蛋白—PB1-F2,該蛋白被認(rèn)為是A型流感病毒重要的毒力因子之一。大量的研究顯示PB1-F2蛋白在宿主細(xì)胞中具有多效性,PB1-F2定位于線粒體上并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;可促進(jìn)宿主繼發(fā)性細(xì)菌感染;能增強(qiáng)病毒聚合酶的活性。凋亡調(diào)節(jié)因子1（modulator of apoptosis 1,MOAP-1）在細(xì)胞線粒體中可與Bax相互作用,當(dāng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中過(guò)表達(dá)時(shí),能夠引發(fā)細(xì)胞凋亡。目前,關(guān)于PB1-F2與宿主蛋白相互作用引發(fā)宿主細(xì)胞線粒體調(diào)亡的分子機(jī)制尚不是十分清楚。本研究利用293T細(xì)胞提取總RNA并成功擴(kuò)增了 MOAP-1基因,然后將MOAP-1基因構(gòu)建到誘餌載體pACT2上。將實(shí)驗(yàn)室已有的pGBKT7-PBl-F2和新構(gòu)建好的pACT2-MOAP-1載體分別轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞中,再將兩種酵母菌液16℃條件融合24h左右,融合后利用缺陷性培養(yǎng)基進(jìn)行單克隆篩選,成功地篩選出了陽(yáng)性克隆。同時(shí)利用酵母雙雜交回轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)和半乳糖苷酶活性實(shí)驗(yàn),對(duì)陽(yáng)性克隆做進(jìn)一步驗(yàn)證。為了進(jìn)一步確證PB1-F2與MOAP-1存在相互作用,構(gòu)建了 MOAP-1基因的多種原核和真核表達(dá)... 

【文章來(lái)源】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)吉林省

【文章頁(yè)數(shù)】：44 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖３．１質(zhì)粒ｐＧＢＫＴ７－ＰＢ卜Ｆ２的ＰＣＲ及酶切鑒定??Ｆｉｇｕｒｅ３．?１?ＰＣＲ?Ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ?ａｎｄ?Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｐＧＢＫＴ７－ＰＢｌ－Ｆ２??

＋?ＰＡＣＴ２－ＭＯＡＰ－１?（０?的載體組）；３．?ｐＧＢＫＴ７?＋?ｐＡＣＴ２?（空白對(duì)照組）；４．?ｐＧＢＫＴ７－Ｐ５３??＋?ｐＡＣＴ２－Ｔ?ａｎｔｉｇｅｎ?（陽(yáng)性對(duì)照組）。四組轉(zhuǎn)化菌涂布在ＳＤ／－Ｔｒｐ／－Ｌｅｕ和??８〇／－丁�。保蓿墸常蓿薰腆w培養(yǎng)基上，３０°（：培養(yǎng)３？５天，生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖３．３。由圖可知，１??組和３組沒(méi)有陰性克隆生長(zhǎng)，這和理論的陰性和空白對(duì)照組不能生長(zhǎng)的結(jié)果一致：２組和４??組有陽(yáng)性克隆生長(zhǎng)且長(zhǎng)勢(shì)相似，這一結(jié)果表明ＰＧＢＫＴ７－ＰＢ１－Ｆ２和ｐＡＣＴ２－ＭＯＡＰ－ｌ酵母表??１９??

地驗(yàn)證了二者之間的相互作用。??典??圖３．?３酵母回轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)??Ｆｉｇｕｒｅ?３．３?Ｒｅ－ｔｒａｎｓｆｏｎｎａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｙｅａｓｔ??３．?１．４?０半乳糖苷酶活性檢測(cè)??為了進(jìn)一步驗(yàn)證ｐＧＢＫＴ７＿ＰＢ卜Ｆ２與ｐＡＣＴ２＿Ｍ０ＡＰ－１的相互作用，通過(guò)濾紙分析法檢??測(cè)陽(yáng)性酵母中Ｐ半乳糖苷酶的活性，同樣將試驗(yàn)分成４組：ｌ．ｐＧＢＫＴ７－ＰＢｌ－Ｆ２?＋??ＰＡＣＴ２－Ｍ０ＡＰ－１?（目的載體組＞?；２．ｐＧＢＫＴ７－Ｐ５３?＋?ｐＡＣＴ２－Ｔ?ａｎｔｉｇｅｎ?（陽(yáng)性對(duì)照組）；３．??ｐＧＢＫＴ７?＋?ｐＡＣＴ２?（空白對(duì)照組）；４．?ｐＡＣＴ２－Ｔ?＋?ｐＧＢＫＴ７＿ＬａｍｉｎＣ?（陰性對(duì)照組）。結(jié)果??見(jiàn)圖３．４，由圖可知１號(hào)的ｐＧＢＫＴ７－ＰＢ１－Ｆ２與ｐＡＣＴ２－Ｍ０ＡＰ－ｌ共轉(zhuǎn)的酵母菌裂解液和２??號(hào)陽(yáng)性對(duì)照組的酵母菌裂解液能在Ｚ－Ｂｕｆｆｅｒ／Ｘ－ｇａｌ的濾紙片上變藍(lán)，而３號(hào)空白對(duì)照組和４??號(hào)陰性對(duì)照組不變藍(lán)。對(duì)比１號(hào)和２號(hào)發(fā)現(xiàn)，濾紙片上的變藍(lán)程度相差不大，說(shuō)明??ＰＧＢＫＴ７－ＰＢ卜Ｆ２與ｐＡＣＴ２＿Ｍ０ＡＰ－１的相互作用和陽(yáng)性對(duì)照組的相互作用的強(qiáng)度相當(dāng)


本文編號(hào)：3223503