禽流感病毒（AIV）以水禽為主要宿主,以其分類亞型眾多、基因變異率高的特點(diǎn)在自然界廣泛存在和傳播。當(dāng)中的H1亞型AIV屬于低致病性A型流感病毒,但其產(chǎn)生的危害也不容忽視。已有大量報(bào)道表明,H1亞型AIV不僅能夠在禽類中傳播,也可以跨越種間屏障感染哺乳動物（如人、豬、馬等）。因此,為了了解廣西地區(qū)H1亞型AIV的生態(tài)流行趨勢,掌握其遺傳進(jìn)化特點(diǎn)以及與豬源和人源H1亞型流感病毒各基因的聯(lián)系和差異,同時為基層臨床和實(shí)驗(yàn)室提供快速、有效的分子生物學(xué)檢測方法,本研究對H1亞型AIV進(jìn)行分離、鑒定、全基因測序、遺傳進(jìn)化分析以及臨床快速檢測方法的建立。本研究從2011年至2012年活禽市場采集的棉拭子樣品中,首先通過血清學(xué)試驗(yàn)進(jìn)行初步篩選、分離與純化,并應(yīng)用H1亞型AIV的二溫氏PCR檢測方法進(jìn)一步確認(rèn),最后進(jìn)行HA基因和NA基因的序列測定。兩年間,本研究在不同的宿主（雞、鴨、鳥）體內(nèi)共分離、純化得到了6株H1亞型AIV,并對其進(jìn)行生物學(xué)特性確定這6株廣西H1亞型AIV分離株均屬于低致病性AIV。通過對6株H1亞型AIV的八個基因片段的全基因序列測定,將其序列測定結(jié)果與NCBI-GenBank上的序... 

【文章來源】：廣西大學(xué)廣西壯族自治區(qū) 211工程院校

【文章頁數(shù)】：119 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
前言
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 禽流感病毒的國內(nèi)外研究進(jìn)展
        1.1.1 禽流感病毒流行歷史概況
        1.1.2 禽流感病毒基因組結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制
        1.1.3 禽流感病毒的復(fù)制
        1.1.4 禽流感病毒抗原變化
        1.1.5 禽流感病毒的感染途徑和方式
    1.2 H1亞型流感病毒的研究進(jìn)展
    1.3 禽流感病毒快速診斷方法的研究進(jìn)展
        1.3.1 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)
        1.3.2 二溫式-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
        1.3.3 巢氏-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
        1.3.4 實(shí)時熒光定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
        1.3.5 多重-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
    1.4 本課題研究意義
第二章 H1亞型禽流感病毒的分離鑒定和生物學(xué)特性研究
    摘要
    2.1 材料與方法
        2.1.1 材料
        2.1.2 方法
    2.2 結(jié)果
        2.2.1 病毒分離結(jié)果
        2.2.2 病毒純化
        2.2.3 RT-PCR檢測鑒定結(jié)果
        2.2.4 HA基因和NA基因測序結(jié)果
        2.2.5 H1亞型禽流感病毒病原性監(jiān)測情況
        2.2.6 雞胚半數(shù)致死量(ELD_(50))和雞胚半數(shù)感染量(EID_(50))的測定結(jié)果
        2.2.7 致病性實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    2.3 討論
第三章 6株H1亞型禽流感病毒全基因序列測定與分析
    摘要
    3.1 材料和方法
        3.1.1 材料
        3.1.2 方法
    3.2 結(jié)果
        3.2.1 6株分離株全基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果
        3.2.2 各毒株基因片段的克隆和序列測定
        3.2.3 6株H1N2亞型禽流感病毒全基因序列分析
    3.3 討論
第四章 H1亞型禽流感病毒快速檢測方法的建立
    試驗(yàn)一 H1亞型禽流感病毒二溫式PCR檢測方法的建立
        摘要
        4.1 材料與方法
            4.1.1 病毒株
            4.1.2 主要試劑
            4.1.3 引物設(shè)計(jì)與合成
            4.1.4 病毒RNA抽提與反轉(zhuǎn)錄
            4.1.5 二溫式PCR條件的優(yōu)化
            4.1.6 二溫式PCR的特異性試驗(yàn)
            4.1.7 二溫式PCR的敏感性試驗(yàn)
            4.1.8 臨床樣品檢測
        4.2 結(jié)果
            4.2.1 二溫式PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化
            4.2.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果
            4.2.3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果
            4.2.4 臨床樣品檢測結(jié)果
        4.3 討論
    試驗(yàn)二 H1亞型禽流感病毒巢氏PCR檢測方法的建立
        摘要
        4.1 材料與方法
            4.1.1 毒株
            4.1.2 試劑
            4.1.3 引物設(shè)計(jì)與合成
            4.1.4 病毒RNA的抽提與反轉(zhuǎn)錄
            4.1.5 巢氏PCR條件的優(yōu)化
            4.1.6 巢氏PCR的特異性試驗(yàn)
            4.1.7 巢式PCR的敏感性試驗(yàn)
        4.2 結(jié)果
            4.2.1 巢氏PCR條件優(yōu)化結(jié)果
            4.2.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果
            4.2.3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果
        4.3 討論
    試驗(yàn)三 H1亞型禽流感病毒實(shí)時熒光定量PCR檢測方法的建立
        摘要
        4.1 材料與方法
            4.1.1 病毒株
            4.1.2 主要設(shè)備和試劑
            4.1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成
            4.1.4 病毒RNA抽提與反轉(zhuǎn)錄
            4.1.5 標(biāo)準(zhǔn)品的制備
            4.1.6 反應(yīng)條件的優(yōu)化
            4.1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
            4.1.8 特異性試驗(yàn)
            4.1.9 敏感性試驗(yàn)
            4.1.10 重復(fù)性試驗(yàn)
            4.1.11 臨床樣品檢測
        4.2 結(jié)果
            4.2.1 質(zhì)粒DNA濃度的測定
            4.2.2 實(shí)時熒光定量PCR條件優(yōu)化
            4.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
            4.2.4 敏感性試驗(yàn)結(jié)果
            4.2.5 特異性試驗(yàn)結(jié)果
            4.2.6 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果
            4.2.7 臨床檢測結(jié)果
        4.3 討論
    試驗(yàn)四 H1和H3亞型禽流感病毒二重PCR檢測方法的建立
        摘要
        4.1 材料與方法
            4.1.1 試劑
            4.1.2 毒株
            4.1.3 引物設(shè)計(jì)與合成
            4.1.4 病毒RNA抽提與反轉(zhuǎn)錄
            4.1.5 二重PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化
            4.1.6 二重PCR的特異性試驗(yàn)
            4.1.7 二重PCR的敏感性試驗(yàn)
            4.1.8 臨床樣品檢測
        4.2 結(jié)果
            4.2.1 二重PCR條件的優(yōu)化
            4.2.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果
            4.2.3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果
            4.2.4 臨床樣品檢測結(jié)果
        4.3 討論
    試驗(yàn)五 H1、H3亞型禽流感病毒和M基因三重RT-PCR檢測方法的建立
        摘要
        4.1 材料與方法
            4.1.1 試驗(yàn)材料
            4.1.2 引物設(shè)計(jì)與合成
            4.1.3 病毒RNA抽提與反轉(zhuǎn)錄
            4.1.4 陽性質(zhì)粒的制備
            4.1.5 三重PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化
            4.1.6 三重PCR的特異性試驗(yàn)
            4.1.7 三重PCR的敏感性試驗(yàn)
            4.1.8 臨床樣品檢測
        4.2 結(jié)果
            4.2.1 三重PCR條件的優(yōu)化結(jié)果
            4.2.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果
            4.2.3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果
            4.2.4 臨床樣品檢測結(jié)果
        4.3 討論
第五章 H1亞型禽流感病毒多種快速檢測方法的比較
    摘要
    5.1 材料與方法
        5.1.1 病毒株
        5.1.2 RNA的抽提
        5.1.3 病毒RNA的梯度稀釋
        5.1.4 病毒RNA濃度的測定
        5.1.5 RNA的反轉(zhuǎn)錄
        5.1.6 引物的合成
        5.1.7 六種檢測方法的最佳擴(kuò)增條件
    5.2 結(jié)果
        5.2.1 病毒RNA敏感性檢測結(jié)果
    5.3 討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
個人簡歷
攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況



本文編號：3223336