提高家畜產(chǎn)肉性能,培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的肉用家畜新品種是育種工作的目標(biāo)之一,通過基因編輯技術(shù)可以快速改變特定基因組成,獲得需要的優(yōu)良性狀。MSTN基因?yàn)楣趋兰∩L(zhǎng)的負(fù)調(diào)控因子,該基因的突變會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物肌肉發(fā)達(dá)、體重增加；fat-1基因編碼ω-3多不飽和脂肪酸脫氫酶,可以將多不飽和脂肪酸從ω-6轉(zhuǎn)化為ω-3形式,fat-1基因的增加有利于提高動(dòng)物體內(nèi)ω-3的含量。本研究利用最新的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建了敲除山羊MSTN基因的同時(shí)在該位點(diǎn)插入fat-1基因的gRNA載體和fat-1基因定點(diǎn)敲入載體,利用電轉(zhuǎn)法將載體轉(zhuǎn)入絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞中,篩選陽性單克隆細(xì)胞,通過體細(xì)胞克隆的方法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因絨山羊,期望培育出在提高羊肉產(chǎn)量的同時(shí)增加羊肉中ω-3含量的家畜新品種。1、載體的構(gòu)建本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了2對(duì)基于MSTN基因一號(hào)外顯子的gRNA表達(dá)載體,通過Survery酶切突變檢測(cè)gRNA2突變效率高于gRNA1;同時(shí)成功構(gòu)建了含有fat-1外源基因且可以定點(diǎn)整合至宿主基因組MSTN位點(diǎn)的敲入載體5’h-pCAGD NA3-fat-1-3’h。2、轉(zhuǎn)基因單克隆細(xì)胞系的篩選本實(shí)驗(yàn)使用電轉(zhuǎn)法將線性化... 

【文章來源】：內(nèi)蒙古大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū) 211工程院校

【文章頁數(shù)】：78 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞表
第一部分：實(shí)驗(yàn)部分
    第一章：載體的構(gòu)建
        1 材料
            1.1 主要儀器設(shè)備
            1.2 實(shí)驗(yàn)材料和試劑
        2 方法
            2.1 CRISPR/Cas9表達(dá)載體的構(gòu)建和效率檢測(cè)
            2.2 敲入載體fat-1(5’h-pCAGDNA3-fat-1-3’h)的構(gòu)建
        3 結(jié)果
            3.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的優(yōu)化和sgRNA表達(dá)載體的構(gòu)建
            3.2 Surveyor突變檢測(cè)結(jié)果
            3.3 敲入載體fat-1(5’h-pCAGDNA3-fat-1-3’h)的構(gòu)建
        4. 討論
            4.1 CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯
            4.2 敲入載體5’h-pCAGDNA3-fat-1-3’h載體的構(gòu)建
        參考文獻(xiàn)
    第二章 CRISPR/Cas9介導(dǎo)的MSTN基因敲除同時(shí)定點(diǎn)整合外源基因fat-1單克隆細(xì)胞的篩選
        1. 材料
            1.1 主要儀器設(shè)備
            1.2 化學(xué)試劑與耗材
            1.3 實(shí)驗(yàn)材料
        2 方法
            2.1 電穿孔法轉(zhuǎn)染GEFs
            2.2 單克隆細(xì)胞系的挑選
            2.3 基因修飾細(xì)胞系的鑒定
        3 結(jié)果
            3.1 轉(zhuǎn)基因單克隆細(xì)胞系的篩選
            3.2 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的鑒定
        4 討論
        參考文獻(xiàn)
    第三章 核移植技術(shù)制備轉(zhuǎn)基因阿爾巴斯絨山羊
        1 材料
            1.1 化學(xué)試劑與實(shí)驗(yàn)材料
            1.2 主要儀器設(shè)備
        2 方法
            2.1 供體細(xì)胞的制備
            2.2 受體卵母細(xì)胞的收集和體外成熟培養(yǎng)
            2.3 卵子去核和體細(xì)胞核移植
            2.4 體細(xì)胞和去核卵母細(xì)胞的融合
            2.5 重構(gòu)胚的激活
            2.6 重構(gòu)胚胎的體外培養(yǎng)
            2.7 克隆胚胎移植
            2.8 妊娠檢查
            2.9 轉(zhuǎn)基因羊的接產(chǎn)
        3 結(jié)果
            3.1 供體細(xì)胞的制備
            3.2 卵母細(xì)胞的采集與成熟培養(yǎng)
            3.3 重構(gòu)胚的構(gòu)建及融合
            3.4 重構(gòu)胚的體外培養(yǎng)及移植
            3.5 克隆胚胎移植及妊娠檢查
            3.6 轉(zhuǎn)基因羊的接產(chǎn)及鑒定
        4 討論
        參考文獻(xiàn)
    結(jié)論
第二部分 綜述部分
    1 CRISPR/Cas技術(shù)概述
        1.1 CRISPR/Cas的研究歷史
        1.2 CRISPR/Cas的結(jié)構(gòu)
        1.3 CRISPR/Cas9技術(shù)介導(dǎo)基因組靶向修飾的作用機(jī)理
    2 CRISPR/Cas9技術(shù)在哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用
        2.1 CRISPR/Cas9技術(shù)在制備轉(zhuǎn)基因敲除動(dòng)物中的應(yīng)用
        2.2 CRISPR/Cas9技術(shù)在制備轉(zhuǎn)基因敲入動(dòng)物中的應(yīng)用
        2.3 CRISPR/Cas9技術(shù)在制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)的優(yōu)、缺點(diǎn)
    3 展望
    參考文獻(xiàn)
附錄
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]一種新的由CRISPR/Cas系統(tǒng)介導(dǎo)的基因組靶向修飾技術(shù)[J]. 劉思也,夏海濱.  中國(guó)生物工程雜志. 2013(10)
[2]CRISPR/Cas9新型基因打靶系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J]. 李輝,施振旦.  江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào). 2013(04)
[3]肌肉生長(zhǎng)抑制素基因在不同動(dòng)物中的研究進(jìn)展[J]. 李盈,額爾敦木圖,劉圖雅,伊特格勒?qǐng)D,沙日扣,圖雅.  中國(guó)畜牧獸醫(yī). 2013(08)
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[8]一種新的雙元表達(dá)質(zhì)粒pCMV-Myc-IRES-EGFP的構(gòu)建及其表達(dá)[J]. 嚴(yán)飛,趙新宇,鄧洪新,魏于全.  生物工程學(xué)報(bào). 2007(03)
[9]不同供體細(xì)胞及其處理對(duì)豬核移植重構(gòu)胚體外發(fā)育的影響[J]. 張德福,劉東,湯琳琳,王英,陳茵,王凱,王根林,KARL Schellander.  遺傳. 2007(02)
[10]牛胎兒成纖維細(xì)胞的組織塊貼附法分離培養(yǎng)與電穿孔法基因轉(zhuǎn)染[J]. 楊東山,杜晨光,高飛,旭日干.  動(dòng)物學(xué)研究. 2006(01)

博士論文
[1]ZFNs介導(dǎo)的牛MSTN位點(diǎn)的基因打靶研究[D]. 趙宇航.內(nèi)蒙古大學(xué) 2014
[2]牛體細(xì)胞克隆中異常重編程的分析及提高重編程效率的研究[D]. 蘇建民.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2012
[3]轉(zhuǎn)fat-1基因體細(xì)胞克隆綿羊的研究[D]. 張東.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 2011
[4]牛體細(xì)胞克隆中供體和受體細(xì)胞制備及重構(gòu)胚構(gòu)建的影響因素研究[D]. 高國(guó)龍.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2007

碩士論文
[1]CRISPR-Cas9技術(shù)介導(dǎo)阿爾巴斯白絨山羊MSTN基因敲除的研究[D]. 劉健.內(nèi)蒙古大學(xué) 2015
[2]Edar基因敲除絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞系的構(gòu)建[D]. 郝斐.內(nèi)蒙古大學(xué) 2013



本文編號(hào)：3220501