為了解犬冠狀病毒（CCV）江蘇分離毒株（JS1706）M基因的分子特性,對其全序列進(jìn)行了擴(kuò)增和序列分析。結(jié)果表明,該基因ORF全長為792 bp,編碼263個氨基酸。與CCV參考毒株（I型和II型）進(jìn)行核苷酸和氨基酸同源性比較,其同源性分別為86.3%～98.7%,88.2%～99.2%。進(jìn)化樹分析表明,JS1706株與CCVⅡ型國內(nèi)流行株NJ17、NTU 366共屬一個分支。生物信息學(xué)分析表明,M蛋白有一個17個氨基酸構(gòu)成的信號肽區(qū)域,3個跨膜區(qū)和3個N-糖基化位點。根據(jù)基因序列推測M蛋白的分子量為29 823。將擴(kuò)增得到的M基因全序列片段經(jīng)純化后與載體pCDNA3.1連接,構(gòu)建了pCDNA3.1CCV-M真核表達(dá)質(zhì)粒,在293T細(xì)胞上能成功表達(dá)。本研究結(jié)果不僅有助于了解國內(nèi)CCV的M基因分子特性,也為CCV分子快速診斷和疫苗研究奠定了基礎(chǔ)。 

【文章來源】：畜牧與獸醫(yī). 2020,52(04)北大核心

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

CCV JS1706株M基因的PCR擴(kuò)增

根據(jù)基因序列推測的M蛋白相對分子質(zhì)量為29 823,理論pI值為 8.71。用SingalP4. 1 在線程序預(yù)測該蛋白的信號肽結(jié)果顯示,M蛋白僅有一個信號肽區(qū)域,氨基酸位置為1～17;利用NetNGlyc 1.0 Server在線程序預(yù)測M蛋白的糖基化位點,結(jié)果顯示,該蛋白N糖基化位點(Asn-X-Ser/Thr)有3個,氨基酸和位置分別為33NGT,56NFS,252NLS;利用 TMHMM2.0在線程序預(yù)測該毒株M蛋白的跨膜區(qū)有3個,氨基酸位置為48～70,77～99,114～136。2.5 真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

分別以表1中所列引物,質(zhì)粒pcDNA3.1以及病毒cDNA為模板PCR擴(kuò)增出CCV的M基因以及線性化載體;PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析后可見特異性條帶,pcDNA3.1載體約為5 000 bp,片段約為792 bp;大小與預(yù)期相符(見圖3A)。切取含目的基因的凝膠,分別回收純化后,用重組酶Exnase TM Ⅱ進(jìn)行快速克隆。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,挑取4個單個菌落,用pCDNA3.1載體的正向引物進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析后,該4個菌落都可擴(kuò)出特異性條帶,其大小與預(yù)期結(jié)果相符(見圖3B)。經(jīng)質(zhì)粒制備與序列測定后,將CCV的M基因陽性重組質(zhì)粒命名為pcDNA3.1-CCV-M。2.6 CCV-M質(zhì)粒的真核表達(dá)鑒定

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]犬冠狀病毒TN449株M基因的克隆與轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建[J]. 張建武,王權(quán),李健,胡永強(qiáng),呂彩云,陳燕軍,薛飛群,林矯矯.  中國獸醫(yī)科技. 2005(08)
[2]犬冠狀病毒在我國首次分離成功[J].   中國獸醫(yī)學(xué)報. 1996(01)



本文編號：3215520