狂犬�。≧abies）是由狂犬病病毒（Rabies virus, RV）感染引起的侵害中樞神經(jīng)系統(tǒng)的人獸共患病，一旦發(fā)病，致死率幾乎為100%。目前疫苗接種是預(yù)防狂犬病的主要措施之一�？袢〔《綼G株是我國(guó)狂犬病人用疫苗毒株，其病毒全基因組序列尚未報(bào)道，因此該病毒的基因組結(jié)構(gòu)、基因組組成特點(diǎn)、病毒與其它毒株之間的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近關(guān)系等尚不清楚。本研究選擇aG毒株作為研究對(duì)象，在對(duì)其進(jìn)行了全基因組序列的測(cè)定以及特征分析的基礎(chǔ)上，完成了病毒全長(zhǎng)cDNA以及構(gòu)成病毒核糖核蛋白復(fù)合物的3個(gè)輔助質(zhì)粒構(gòu)建，通過共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞建立了該毒株的反向遺傳學(xué)操作系統(tǒng)，主要研究成果如下：1．首次對(duì)狂犬病病毒aG毒株全基因組序列進(jìn)行了測(cè)定，并將其基因組序列與Genbank中收錄的其它狂犬病病病毒疫苗株進(jìn)行了比對(duì)分析，其結(jié)果顯示，aG株全長(zhǎng)為11925nt，基因組包含5個(gè)完整的開放閱讀框，分別編碼核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、糖蛋白（G）以及轉(zhuǎn)錄大蛋白（L）。基因組3′端前導(dǎo)序列和5′末端序列長(zhǎng)度分別為58bp和70bp�；蜷g隔區(qū)長(zhǎng)度分別為2bp、5bp、5bp以及24bp，基因組兩端的11個(gè)... 

【文章來源】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁(yè)數(shù)】：112 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
附件
摘要
Abstract
英文縮略表
第一章 緒論
    1.1 研究背景
    1.2 研究現(xiàn)狀
        1.2.1 傳統(tǒng)弱毒疫苗和滅活疫苗
        1.2.2 基因工程亞單位疫苗
        1.2.3 基因工程重組活載體疫苗
        1.2.4 DNA 疫苗
        1.2.5 反向遺傳學(xué)弱毒苗
        1.2.6 其它疫苗
    1.3 研究的目的和意義
第二章 RV aG 毒株全基因組序列測(cè)定及生物信息學(xué)分析
    2.1 材料與方法
        2.1.1 材料
        2.1.2 病毒
        2.1.3 菌種與載體
        2.1.4 試劑盒與儀器
        2.1.5 引物設(shè)計(jì)
        2.1.6 病毒全基因組 RNA 的提取
        2.1.7 cDNA 的合成
        2.1.8 目的片段的 PCR 擴(kuò)增
        2.1.9 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的回收
        2.1.10 PCR 產(chǎn)物與 pMD-18-T simple 載體連接
        2.1.11 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
        2.1.12 菌落的篩選與鑒定
        2.1.13 質(zhì)粒 DNA 的小量制備
        2.1.14 質(zhì)粒的鑒定
        2.1.15 病毒基因組末端序列的測(cè)定
        2.1.16 序列比對(duì)與分析
        2.1.17 G 基因和 N 基因的生物信息學(xué)分析
    2.2 結(jié)果
        2.2.1 aG 毒株基因組擴(kuò)增與基因組結(jié)構(gòu)
        2.2.2 aG 毒株基因組末端擴(kuò)增
        2.2.3 aG 毒株核苷酸特點(diǎn)
        2.2.4 aG 毒株結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)構(gòu)特點(diǎn)
        2.2.5 aG 毒株 N 基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析
        2.2.6 aG 毒株 G 基因和 N 基因的生物信息學(xué)分析
    2.3 討論
    2.4 小結(jié)
第三章 狂犬病病毒 CVS-24 株全基因組測(cè)序及生物信息學(xué)分析
    3.1 材料與方法
        3.1.1 病毒
        3.1.2 菌種與載體
        3.1.3 試劑盒與儀器
        3.1.4 引物設(shè)計(jì)
        3.1.5 病毒全基因組 RNA 的提取
        3.1.6 cDNA 的合成
        3.1.7 目的片段的 PCR 擴(kuò)增
        3.1.8 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的回收
        3.1.9 PCR 產(chǎn)物與 pMD18-T simple 載體連接
        3.1.10 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
        3.1.11 菌落的篩選與鑒定
        3.1.12 質(zhì)粒 DNA 的小量制備
        3.1.13 質(zhì)粒的鑒定
        3.1.14 病毒基因組末端序列的測(cè)定
        3.1.15 序列比對(duì)與分析
        3.1.16 G 蛋白與 N 蛋白的生物信息學(xué)分析
    3.2 結(jié)果
        3.2.1 CVS-24 毒株全基因組擴(kuò)增與基因組結(jié)構(gòu)
        3.2.2 基因組兩端擴(kuò)增
        3.2.3 G 蛋白和 N 蛋白的生物信息學(xué)分析
    3.3 討論
    3.4 小結(jié)
第四章 RV aG 毒株全長(zhǎng) cDNA 的設(shè)計(jì)與構(gòu)建
    4.1 材料與方法
        4.1.1 材料
        4.1.2 病毒總 RNA 的提取
        4.1.3 引物設(shè)計(jì)
        4.1.4 cDNA 的合成
        4.1.5 目的片段的 PCR 擴(kuò)增
        4.1.6 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的回收
        4.1.7 PCR 產(chǎn)物與 pMD-18-T simple 載體連接
        4.1.8 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
        4.1.9 菌落的篩選與鑒定
        4.1.10 質(zhì)粒 DNA 的小量制備
        4.1.11 重組質(zhì)粒的鑒定
        4.1.12 aG 毒株全長(zhǎng) cDNA 重組真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
    4.2 結(jié)果
        4.2.1 病毒全長(zhǎng)基因組分段擴(kuò)增結(jié)果
        4.2.2 克隆載體的酶切鑒定
        4.2.3 重組真核表達(dá)載體的酶切鑒定
    4.3 討論
    4.4 小結(jié)
第五章 RV aG 株輔助質(zhì)粒的設(shè)計(jì)與構(gòu)建
    5.1 材料與方法
        5.1.1 材料
        5.1.2 病毒總 RNA 的提取
        5.1.3 引物設(shè)計(jì)
        5.1.4 cDNA 的合成
        5.1.5 目的片段的 PCR 擴(kuò)增
        5.1.6 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的回收
        5.1.7 PCR 產(chǎn)物與 pMD-18-T simple 載體連接
        5.1.8 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
        5.1.9 菌落的篩選與鑒定
        5.1.10 質(zhì)粒 DNA 的小量制備
        5.1.11 重組質(zhì)粒的鑒定
        5.1.12 aG 株輔助重組真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
    5.2 結(jié)果
        5.2.1 各基因 PCR 擴(kuò)增結(jié)果
        5.2.2 攜帶目的基因的 T 載體酶切驗(yàn)證
        5.2.3 表達(dá) N、P、L 蛋白的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體構(gòu)建
    5.3 討論
    5.4 小結(jié)
第六章 RV aG 毒株反向遺傳操作系統(tǒng)的初步建立
    6.1 材料
        6.1.1 細(xì)胞
        6.1.2 主要試劑
    6.2 方法
        6.2.1 包含有全長(zhǎng) cDNA 以及輔助質(zhì)粒的細(xì)菌的大量培養(yǎng)
        6.2.2 無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取
        6.2.3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的準(zhǔn)備
        6.2.4 轉(zhuǎn)染拯救重組病毒
        6.2.5 拯救病毒的鑒定
    6.3 結(jié)果
        6.3.1 RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果
        6.3.2 重組病毒毒力檢測(cè)
    6.4 討論
    6.5 小結(jié)
第七章 全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)歷
附錄


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]表達(dá)狂犬病毒糖蛋白抗原的重組犬2型腺病毒的構(gòu)建及鑒定[J]. 趙忠鵬,夏咸柱,扈榮良,謝之景,閆芳,黃耕,楊松濤.  微生物學(xué)報(bào). 2007(02)



本文編號(hào)：3207216