恒定鏈（invariant chain, Ii）是脊椎動(dòng)物重要的免疫分子,在MHC遞呈抗原中起重要作用。但是對(duì)Ii的研究主要集中于人和小鼠,而雞Ii的研究相對(duì)滯后。近年發(fā)展的RNA干擾技術(shù)是一種強(qiáng)大的基因功能研究工具,被廣泛的應(yīng)用于基因功能的研究和基因治療。為研究雞Ii與MHCⅡ類(lèi)分子的關(guān)系,本實(shí)驗(yàn)利用RNAi技術(shù)構(gòu)建了4個(gè)沉默雞Ii的慢病毒重組載體并比較了它們的沉默效率。首先,用自行設(shè)計(jì)合成的4個(gè)雞Ii基因干擾序列經(jīng)退火形成雙鏈shRNA片段,再將其插入慢病毒載體pLL3.7。應(yīng)用PCR、酶切和測(cè)序鑒定后,將正確的重組慢病毒載體與輔助包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染于293T細(xì)胞進(jìn)行病毒的包裝,待病毒收獲處理后,再感染雞源巨噬細(xì)胞HD-11,最后用熒光定量PCR檢測(cè)雞Ii mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。測(cè)序結(jié)果顯示我們正確構(gòu)建了4個(gè)重組慢病毒干擾載體,它們分別被命名為pLL-Ii-shRNA236. pLL-Ii-shRNA376、pLL-Ii-shRNA527 和 pLL-Ii-shRNA539.共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后,培養(yǎng)48h能在熒光顯微鏡下觀察到熒光表達(dá),說(shuō)明成功包裝了慢病毒,分別命名為L(zhǎng)V-shRN... 

【文章來(lái)源】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)安徽省

【文章頁(yè)數(shù)】：58 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
本論文常用中英文縮寫(xiě)詞
文獻(xiàn)綜述
引言
1 材料與方法
    1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1.1 質(zhì)粒、菌株與細(xì)胞株
        1.1.2 工具酶與相關(guān)試劑
        1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)用試劑配置方法
        1.1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器
    1.2 實(shí)驗(yàn)方法
        1.2.1 靶向雞Ii基因shRNA序列的設(shè)計(jì)與合成
        1.2.2 互補(bǔ)單鏈退火形成雙鏈shRNA片段
        1.2.3 慢病毒載體質(zhì)粒pLL3.7的線性化
        1.2.4 重組慢病毒載體的構(gòu)建
        1.2.5 陽(yáng)性克隆的PCR篩選與鑒定
        1.2.6 陽(yáng)性克隆的單酶切驗(yàn)證與測(cè)序
        1.2.7 重組慢病毒載體質(zhì)粒的包裝
        1.2.8 慢病毒滴度的檢測(cè)
        1.2.9 熒光定量PCR檢測(cè)Ii基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平
2 結(jié)果與分析
    2.1 靶向雞Ii基因shRNA退火后的檢測(cè)
    2.2 慢病毒載體pLL3.7的雙酶切結(jié)果
    2.3 重組慢病毒載體的PCR鑒定
    2.4 重組慢病毒載體的酶切鑒定
    2.5 重組慢病毒載體的測(cè)序結(jié)果
    2.6 無(wú)內(nèi)毒素重組質(zhì)粒的檢測(cè)
    2.7 重組慢病毒的包裝與滴度檢測(cè)結(jié)果
    2.8 慢病毒感染HD-11細(xì)胞及其感染效率的測(cè)定
    2.9 總RNA的鑒定
    2.10 熒光定量PCR比較4個(gè)重組載體沉默雞Ii基因的效率
3 討論
    3.1 RNA干擾應(yīng)用方式的選擇
    3.2 shRNA的設(shè)計(jì)
    3.3 慢病毒的包裝與保存
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)介



本文編號(hào)：3200690