弓形蟲是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的頂復(fù)門原蟲,是非常重要的人獸共患病原體,感染全球三分之一以上的人口和難以計數(shù)的野生動物與家畜,造成嚴(yán)重的社會問題和巨大的經(jīng)濟損失。弓形蟲生活史復(fù)雜,在中間宿主體內(nèi)有速殖子和緩殖子兩種形式,對應(yīng)急性和慢性感染,這二者之間能夠相互轉(zhuǎn)化且這種轉(zhuǎn)化是弓形蟲傳播和致病的關(guān)鍵因素。闡明速殖子和緩殖子時期蟲體的生長代謝規(guī)律對理解其生活史和設(shè)計藥物與疫苗非常重要。速殖子和緩殖子存在明顯的代謝活動差異,絕大多數(shù)糖酵解酶在蟲體中有兩個亞型,且每一對中兩個亞型的表達(dá)在速殖子與緩殖子期呈顯著差異。此外,當(dāng)前的模型認(rèn)為,弓形蟲速殖子有很好的代謝靈活性,葡萄糖作為碳源的代謝可以被谷氨酰胺取代而不明顯影響蟲體生長。那么糖酵解在蟲體生長發(fā)育中到底有什么作用?帶著這個問題,本研究選取糖酵解中的乳酸脫氫酶（LDH）和丙酮酸激酶（PYK）為研究對象,采用遺傳學(xué)、代謝組學(xué)和生物化學(xué)等方法研究它們在蟲體生長發(fā)育中的生物學(xué)作用,具體包括:（1）乳酸發(fā)酵對體內(nèi)弓形蟲生長的關(guān)鍵作用及機制弓形蟲表達(dá)兩個乳酸脫氫酶,我們對速殖子期特異性表達(dá)的LDH1和緩殖子期特異性表達(dá)的LDH2進行單獨或者聯(lián)合敲除,結(jié)果表明... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：142 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
縮略語表
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 弓形蟲是非常重要的人畜共患病原體
        1.1.1 弓形蟲及其危害
        1.1.2 弓形蟲速殖子與緩殖子
        1.1.3 弓形蟲基因型與毒力
    1.2 弓形蟲疫苗
        1.2.1 弓形蟲滅活疫苗和亞單位疫苗
        1.2.2 弓形蟲減毒活疫苗
    1.3 弓形蟲感染與宿主免疫反應(yīng)
    1.4 弓形蟲表現(xiàn)代謝靈活多樣性
        1.4.1 弓形蟲的糖代謝途徑
        1.4.2 糖代謝途徑的生物學(xué)意義尚存爭議
        1.4.3 弓形蟲的脂代謝途徑
        1.4.4 糖酵解酶在弓形蟲脂代謝途徑中的作用與生物學(xué)意義尚不明了
    1.5 弓形蟲CRISPR-Cas9基因編輯和四環(huán)素(ATC)調(diào)控系統(tǒng)
    1.6 尚待解決的科學(xué)問題
第二章 乳酸脫氫酶對弓形蟲生長發(fā)育的作用與機制研究
    2.1 研究目的與意義
    2.2 實驗材料
        2.2.1 實驗動物
        2.2.2 引物與質(zhì)粒
        2.2.3 實驗菌株、細(xì)胞和蟲株
        2.2.4 主要儀器與試劑
        2.2.5 主要溶液與試劑的配制
    2.3 實驗方法
        2.3.1 弓形蟲的培養(yǎng)、收集與純化
        2.3.2 弓形蟲基因組g DNA的提取
        2.3.3 弓形蟲RNA的提取
        2.3.4 弓形蟲cDNA的制備
        2.3.5 PCR擴增目的片段
        2.3.6 目的片段回收
        2.3.7 同源重組質(zhì)粒構(gòu)建
        2.3.8 CRISPR質(zhì)粒構(gòu)建
        2.3.9 大腸桿菌化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞的制備
        2.3.10 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化
        2.3.11 HFF細(xì)胞及弓形蟲的復(fù)蘇
        2.3.12 HFF細(xì)胞的傳代培養(yǎng)
        2.3.13 HFF細(xì)胞及弓形蟲的凍存
        2.3.14 敲除株及回補蟲株的構(gòu)建及鑒定
        2.3.15 空斑實驗
        2.3.16 弓形蟲速殖子復(fù)制實驗
        2.3.17 緩殖子轉(zhuǎn)化率實驗
        2.3.18 弓形蟲緩殖子復(fù)制實驗
        2.3.19 毒力實驗
        2.3.20 ELASE檢測小鼠血清
        2.3.21小鼠體內(nèi)荷蟲量實驗
        2.3.22 熒光定量PCR(qPCR)實驗
        2.3.23 弓形蟲腦包囊形成實驗
        2.3.24 GC/LC-MS進行代謝分析
        2.3.25 寡霉素A敏感性試驗
        2.3.26 統(tǒng)計分析
    2.4 結(jié)果與分析
        2.4.1 在體外標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下,LDH對弓形蟲的生長不重要
        2.4.2 LDH1缺失導(dǎo)致弓形蟲毒力減弱和腦包囊數(shù)量減少
        2.4.3 回補LDH1恢復(fù)弓形蟲毒力和緩殖子形成能力
        2.4.4 LDH1和LDH2的雙缺失進一步降低弓形蟲的毒力
        2.4.5 LDH敲除阻斷乳酸產(chǎn)生,導(dǎo)致糖酵解紊亂
        2.4.6 LDH對弓形蟲在宿主體內(nèi)繁殖非常關(guān)鍵
        2.4.7 LDH對低氧條件下弓形蟲的生長非常關(guān)鍵
        2.4.8 LDH敲除蟲株對氧化磷酸化抑制劑寡霉素A高度敏感
    2.5 討論
    2.6 結(jié)論
第三章 乳酸脫氫酶敲除蟲株免疫保護性評估與機制研究
    3.1 研究目的與意義
    3.2 材料與方法
        3.2.1 實驗動物
        3.2.2 細(xì)胞和蟲株
        3.2.3 腦包囊毒力實驗
        3.2.4 小鼠活體成像實驗
        3.2.5 免疫保護力實驗
        3.2.6 ELISA檢測血清抗體
        3.2.7 被動免疫實驗
        3.2.8 免疫小鼠脾細(xì)胞懸液的制備
        3.2.9 BCA法測全蟲抗原濃度
        3.2.10 脾細(xì)胞培養(yǎng)上清細(xì)胞因子檢測
        3.2.11 統(tǒng)計分析
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 ME49Δldh腦包囊的毒力嚴(yán)重減弱
        3.3.2 ME49Δldh免疫接種引起對速殖子感染的強免疫保護性
        3.3.3 免疫Δldh產(chǎn)生對緩殖子感染的免疫保護
        3.3.4 免疫接種Δldh阻斷再感染組織包囊的形成
        3.3.5 免疫接種Δldh能夠快速清除再感染的野生型蟲體
        3.3.6 免疫接種Δldh顯著增加細(xì)胞因子和特異性IgG抗體的水平
        3.3.7 Δldh免疫接種小鼠的血清對弓形蟲再感染提供部分免疫保護
        3.3.8 全蟲抗原刺激Δldh免疫小鼠的脾細(xì)胞產(chǎn)生高水平的細(xì)胞因子
    3.4 討論
    3.5 結(jié)論
第四章 丙酮酸激酶對弓形蟲生長及代謝的關(guān)鍵作用與機制研究
    4.1 研究目的與意義
    4.2 材料與方法
        4.2.1 實驗動物
        4.2.2 實驗菌株和細(xì)胞
        4.2.3 質(zhì)粒和蟲株
        4.2.4 主要試劑及配制
        4.2.5 SDS-PAGE凝膠電泳
        4.2.6 Western-blot
        4.2.7 入侵實驗
        4.2.8 ATP含量檢測
        4.2.9 弓形蟲頂質(zhì)體數(shù)量檢測
        4.2.10 生長缺陷和頂質(zhì)體丟失可逆性檢測
        4.2.11 弓形蟲頂質(zhì)體、線粒體、細(xì)胞核g DNA檢測
        4.2.12 IFA-PAS染色
        4.2.13 統(tǒng)計分析
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 PYK1對弓形蟲生長非常重要
        4.3.2 移除葡萄糖沒有救援PYK1抑制導(dǎo)致的生長缺陷
        4.3.3 抑制PYK1表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞ATP減少和相關(guān)代謝物水平改變
        4.3.4 PYK1抑制影響~(13)C-葡萄糖的代謝流
        4.3.5 條件性敲除PYK1導(dǎo)致積累大量的支鏈淀粉
        4.3.6 乳酸和丙氨酸可以部分拯救PYK1抑制導(dǎo)致的生長缺陷
        4.3.7 雙缺失PYK1和PYK2完全阻礙弓形蟲生長
        4.3.8 PYK敲除造成頂質(zhì)體丟失
    4.4 討論
    4.5 結(jié)論
第五章 全文總結(jié)與展望
    5.1 全文總結(jié)
    5.2 展望
參考文獻(xiàn)
附錄一
附錄二
附錄三
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]用四環(huán)素誘導(dǎo)調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建弓形蟲脂肪酸合成酶FABZ缺陷株[J]. 吳亮,薛蘭蘭,王曉,吳臘梅,姜旭淦,陳盛霞.  中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志. 2014(04)
[2]頂復(fù)門寄生蟲頂質(zhì)體的研究進展[J]. 張維,劉群.  中國獸醫(yī)科學(xué). 2006(08)

博士論文
[1]弓形蟲硬脂酰輔酶A去飽和酶的鑒定及功能研究[D]. 郝攀.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[2]TALEN和CRISPR技術(shù)在弓形蟲致病機制研究中的應(yīng)用[D]. 張偉超.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[3]與弓形蟲微線體蛋白互作的宿主蛋白的篩選和鑒定[D]. 王一凡.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015

碩士論文
[1]DnaK-TPR與LDH2基因在弓形蟲生長發(fā)育中的功能與調(diào)控機制研究[D]. 張麗紅.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018
[2]運輸應(yīng)激條件下弓形蟲緩殖子向速殖子轉(zhuǎn)化差異蛋白的篩選及鑒定[D]. 袁園.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015
[3]弓形蟲速殖子與緩殖子體外相互轉(zhuǎn)換模型的構(gòu)建[D]. 施遠(yuǎn)香.中南大學(xué) 2014
[4]中國西南地區(qū)貓源弓形蟲株基因分型及毒力研究[D]. 孟德娣.安徽醫(yī)科大學(xué) 2013
[5]兩株豬源剛地弓形蟲的分離及其生物學(xué)特性的研究[D]. 王尚尚.揚州大學(xué) 2012



本文編號：3199607